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5 Diskussion
Die Spätdifferenzierung der humanen Chondrozyten im Rippenknorpel Knorpelmatrix besteht hauptsächlich aus Kollagen II, IX und XI und dem Proteoglycan Aggrecan. In mineralisiertem Knorpel finden sich zusätzlich knochenspezifische Moleküle wie alkalische Phosphatase, Osteonectin, Osteocalcin, Osteopontin und bone sialoprotein(BSP). Die Zusammenlagerung dieser Proteine wird durch Hydroxyapatit in der extrazellulären Matrix stabilisiert. Ferner bilden hypertrophierte Chondrozyten Kollagen X.
Treten Kollagen X, die alkalische Phosphatase und eine Proliferation der Knorpelzellen gemeinsam auf, ist dies ein Merkmal für die terminale Differenzierung des Knorpelgewebes.
Durch immunhistochemische und biochemische Analysen sowie die ultrastrukturelle Untersuchung wurde Kollagen X in der extrazellulären Matrix des Knorpelgewebes nachgewiesen und in Verbindung zum Prozeß der Mineralisation von Knorpelgewebe gebracht. Auch wenn man sich über das Vorkommen von Kollagen X nur in hypertrophierten Knorpel einig ist, bestehen dennoch gegensätzliche Hypothesen über dessen Funktion. Einerseits wird dem Kollagen X eine fördernde Wirkung auf die Mineralisierung zugeschrieben, da kollagen X sowohl an Bestandteile der Matrixvesikel, AnexinVI, Anexin V und alkalische Phosphatase als auch an Kalzium bindet (Wu et al.,1991). Andererseits wird angenommen, daß Kollagen X die Mineralisierung hemmt, weil es perizellulär in Form von Filamentfasern vorliegt, wo keine Mineralisierung statt findet.
Außerdem befindet sich Kollagen X in Eierschalen, die kein Hydroxyapatit aufweisen. (Arias et al.,1991; Schmid et al., 1991)
In unserer Studie haben wir die Spätdifferenzierung im Rippenknorpel während der Entwicklung der Chondrozyten untersucht. Für die Bestimmung der Differenzierung ist es notwendig, die Marker für die terminale Differenzierung im Gewebe und in der Zellkultur nachzuweisen. Frühere Untersuchungen an Rippenknorpel von Classen et al., (1996), Kämpen et al., (1996), und Bonucci et al., 1976, haben eine Spätdifferenzierung an Rippenknorpel ohne Kollagen X-Synthese, eine Degeneration der extrazellulären Matrix, Mineralisation (nach der Pubertät), alkalische Phosohatase-Aktivität (nach der Pubertät) und eine Korrelation der Mineralisation mit der Vaskula-risierung ergeben. Koebke und Saternus, (1982 & 1985) fanden eine reine Ossifikation ohne vorherige Mineralisation. Im 5 Diskussion 95 Gegensatz zu diesen Berichten in der Literatur haben wir Kollagen X sowohl in Zellkultur als auch im Gewebe (vor und nach der Pubertät) nachgewiesen. Außerdem haben wir alkalische Phosphatase-Aktivität und eine Mineralisation der extrazellulären Matrix sowohl im Rippenknorpel (nur nach der Pubertät) als auch in Zellkultur festgestellt. Daher schließen wir, daß alkalische Phosphatase für die Mineralisation essentiell ist.
Bei 5-jährigen Kindern wurde bereits Kollagen X synthetisiert, obwohl die Mineralisation erst nach der Pubertät einsetzt. Daher stellt sich die Frage, ob Kollagen X für die Mineralisation ebenfalls notwendig ist. Da nach der Pubertät auch die alkalische Phosphatase nachweisbar ist und damit die Mineralisation einsetzt, besteht die Möglichkeit, daß beide Faktoren (nicht Kollagen X alleine, sondern zusammen mit alkalischer Phosphatase) die Mineralisation induzieren. Das verzögerte Auftreten der alkalischen Phosphatase und Mineralisation läßt vermuten, daß die Expression von Signalen durch Kollagen X und/oder ALP reguliert werden.Daher empfiehlt es sich, die Konzentration im Rippenknorpel von zB.: TGFß und bFGF vor und nach der Pubertät zu messen, da diese Wachstumsfaktoren in der Lage sind, die Spätdifferenzierung zu inhibieren (Böhme et al., 1995). Da die alkalische Phosphatase und Mineralisation nur nach der Pubertät auftritt, sollte der Zusammenhang zwischen den Sexualhormonen und der Spätdifferenzierung näher untersucht werden.
Bei der serumfreien Kultivierung der Chondrozyten des Rippenknorpels in Agarose- Kultur haben wir festgestellt, daß 50ng/ml Thyroxin, l00ng/ml Insulin und l00ng/ml IGFl keine terminale Differenzierung einleitet. Bei sternalen Hühnerchondrozyten onnte dieses Hormon allerdings eine Spätdifferenzierung induzieren (Böhme et al., 1992). Des weiteren haben wir feststellen können, daß sowohl die C-terminale als auch N-terminale Domäne des Parathormons die terminale Differenzierung von humanen kostalen Chondrozyten einleitet.
Die C-terminale Domäne induziert in serumfreier Zellkultur die Kollagen X-Synthese nach einem Tag und eine erhöhte alkalische Phosphatase-Aktivität nach 13 Tagen. Deshalb könnte man vermuten, daß es einen Inhibitor gibt, der die alkalische Phosphatase-Aktivität blockiert und mit der Zeit nicht mehr exprimiert wird..
Bei der Kultivierung mit verschiedenen Konzentration von FKS wurde Proliferation der kostalen Chondrozyten, Vergrößerung der Zellen, alkalische Phosphatase-Synthese und Kollagen X-Synthese nur durch 10% FKS induziert. Da alkalische Phosphatase bei der Kultivierung mit 10% FKS in drei Tagen festzustellen ist, gehen wir davon aus, daß Negativkontrolle auf die alkalischen Phosphatase-Aktivität vermutlich durch Serumfaktoren aufgehoben wird. Es ist nicht ausgeschlossen, daß weitere Faktoren des FKS bei der Spätdifferenzierung eine Rolle spielen.
Es ist zu bemerken, daß die C-terminale Domäne des Parathormons im Gegensatz zu 10% FKS keine Proliferation und Vergrößerung der Chondrozyten induziert. Das bedeutet, daß Spätdifferenzierung der kostalen Chondrozyten in serumfreie Zellkultur durch Cterminale Domäne von PTH induziert wird (da die Zellen ALP und Kollagen X synthetisieren), ohne daß die Zellen größer werden und proliferieren. Bei der Zugabe von 1% FKS oder Insulin oder IGF1 in Zellkultur wurde festgestellt, daß das Volumen der Zellen zunimmt, ohne daß die Zellen Kollagen X und alkalische Phosphatase synthetisieren.
So vermuten wir, daß Proliferation und Vergrößerung der Zellen keine Merkmale der Spätdifferenzierung der kostalen Chondrozyten sind.
Wir haben bei elektronenmikroskopischen Untersuchungen beobachtet, daß Rippenknorpel nach der Pubertät nur teilweise ossifiziert. Es muß eine Negativkontrolle der endchondralen Ossifikation auf sehr späten Differenzierungsstadien geben. Diese Mechanismen verzögern die Ossifikation von Rippen über sehr lange Zeiträume, obwohl Hypertrophie nach dem Kriterium Kollagen X-Synthese im 5-jährigen Kind bereits vorliegt.
Zinkmangel in Trichterbrustchondrozyten Anhand der laborchemischen Analyse konnte eine „Zinkverarmung” und ein signifikanter Anstieg von Kalzium und Magnesium im brustwanddeformicrenden Rippenknorpel nachgewiesen werden. Elektronenmikroskopische Untersuchungen zeigen die vergrößerten Golgi-Apparate und das vermehrte endoplasmatische Retiku-lum, die eine erhöhte Stoffwechselleistung der Chondrozyten bedeuten (Habilitationsschrift, Dr. Rupprecht Universität Erlangen 1994). Jedoch zeigt sich im extrazellulären Raum eine irreguläre Struktur der Kollagenfibrillen, so daß von einer Störung in der Fibrillenbildung ausgegangen werden muß. Im Rippenknorpelgewebe junger Menschen sind die Fibrillen rundlich mit einem sehr einheitlichen Durchmesser von 17-20 nm zu finden. Rippenknorpel der Trichterbrustpatienten zeigen aber breite dünne Fibrillen so gennante „Amianthoidfibrillen” oder auch „Asbestfasern” (Habilitationsschrift, Dr. Rupprecht Universität Erlangen 1994). Solche Fibrillen treten auch bei Alterung des Rippenknorpels auf (Mallinger und Stockinger, 1988). Deswegen betrachtet man die Trichterbrustkrankheit als Voralterung des Rippenknorpels. Chun-lin et al., 1995 haben festgestellt, daß teilweise prozessiertes Prokollagen II (pN-Kollagen II) in einem Gemisch mit Kollagen II bei der Fibrillogenese die breiten dünnen Fibrillen verursachen. Der gleiche Phänomen haben Holmes et al., 1991 bei der Fibrillogenese eines Gemisches von Kollagen I und pNKollagen I gefunden.
Deswegen haben wir die Prozessierung von Prokollagen II untersucht. Wir haben die Aktivität der Prokollagen-N-Protease in Zellkultur der kostalen Chondrozyten verfolgt.
Dabei haben wir eine Verstärkung der Prozessierung des Prokollagens II durch Zinkzugabe (15mM ZnSO4) festgestellt. Dieses Ergebnis war bei den kostalen Chondrozyten normaler Probanden nicht zu finden. Außerdem haben wir die Zinkkonzentration in kostalen Chondrozyten von Patienten mit Brustwanddeformitäten und normalen Spendern laborchemisch durch Inductiely Coupled Plasma-Mass Spec-trometry (ICP-MS) gemessen.
Anhand der Untersuchung konnte eine „Zinkverarmung” und ein signifikanter Anstieg von Calcium in Chondrozyten bei Trichterbrustdeformitäten nachgewiesen werden. Diese Befunde scheinen eine mangelhafte Aktivität der Prokollagen-N-Protease zu belegen. Diese mangelhafte Aktivität des Enzymes konnte entweder durch die Verarmung der Zinkkonzentration in Chondrozyten von Brustwanddeformitäten oder andere Störung der Prokollagen-N-Protease (z.B die mangelhafte Bindung von Zink an Prokollagen-NProtease), erkälert werden. Die mangelhafte Aktivität der Prokollagen-N-Protease führt zu einer mangelhaften Prozessierung von Prokollagen II und somit zur Bildung von breiten und dünnen Fibrillen (Amianthoidfibrillen), welche zur Bildung „minderwertigen” Knorpels führt. Dieser kann den mechanischen Belastungen bei der In- und Expiration weniger standhalten und führt so zur einer Brustwanddeformitäten. In einer tierexperimentellen Studie konnte bei schwangeren Ratten mit Zinkmangel vergleichbare morphologische Befunde bei deren Jungen im Rippenknorpel nachgewiesen werden (Habilitationsarbeit von Dr. Rupprecht Uni. Erlangen 1994).
Beim Zinkmangel in Chondrozyten von Brustwanddeformitäten kann die Speicherung
von Zink, der Transport von Zink in extrazellulärer Matrix oder die intrazelluläre Aufnahme von Zink gestört sein.
Zinkionen werden von Trichterbrustchondrozyten-Kulturen intrazellulär aufgenommen und verstärken über die Prokollagen-N-Protease die Prozessierung von Prokollagen II in der extrazellulären Matrix. Desweiteren können Zinkionen bei diesen Kulturen mindestens bis 20 Tage gespeichert werden.
Bei den Gewebeproben des Rippenknorpels von Trichterbrustpatienten wurden die Zinkionen aber selbst nach 10 Tagen nicht intrazellulär in die Chondrozyten aufgen-nomen.
Für dieses Phänomen sind zwei Gründe denkbar:
a) freie Zinkionen sind bei den Gewebeproben nicht in der Lage, die extrazelluläre Matrix zu passieren, und/oder von Trichterbrustchondrozyten im Gewebe aufgenommen zu werden, sondern benötigen dafür ein Transportprotein.
b) Es gibt Liganden in der extrazelluären Matrix des Trichterbrustknorpel, die Zinkionen auffangen und dadurch den Zinktransport verhindern.
Unsere Aussagen über Zinkaufnahme, Zinktransport und Zinkspeicherung gelten für freien Zinkionen unter fest definierten in vitro-Bedingungen.
Die Differenzierung der Osteoblasten-ähnlichen Zellen in dreidimensionaler Matrix Die Osteoblasten-ähnlichen Zellen stammen von primär-mesenchymalen Vorläuferzellen, die als Hilfsmittel für diese Studie eingesetzt wurden. Während der folgenden 2- wöchigen Beobachtung der Monolayer-Kulturen zeigen die Zellen den morphologischen und biochemischen Charakter von Osteoblasten. Die Zellen synthetisieren extrazelluläre Proteine (Kollagen I,V) und alkalische Phosphatase, die für Knochengewebe typisch sind.
Die Produktion dieser Kollagene durch andere knochenbezogene Zellen in vitro wurde in früheren Studien dargestellt (Cohentanugi et al., 1996; Byers et al., 1999; Aubin 1999).
Außerdem produzieren die Zellen auch Kollagen III, welches nicht unbedingt spezifisch für Osteoblasten ist (Van der Rest, 1991). Dieses Protein ist jedoch in spezifischen Knochenbereichen, einschließlich der Kortikalknochen in der Nähe der pe-riostalen Oberfläche immunelektronenmikroskopisch identifiziert worden. Diese Beobachtungen stimmen mit der Aussage überein, daß einige Typen von Osteoblasten noch die Kapazität von mesenchymalen Vorläuferzellen in Bezug auf die Kollagen III-Synthese enthalten. Es
wurde darüber spekuliert, daß die Osteoblasten-ähnlichen Zellen ähnlich wie die spezialisierten Osteoblasten Varianten sind, welche in vivo in der Nähe von Kortikal- Knochen-Oberflächen vorliegen. Solche Zellen, die sich in tieferen Zonen befinden, weisen keine Fähigkeit zur Kollagen III -Synthese auf. Jedoch liefert die Umgebung in unserer Monolayer-Kultur keine Hinweise auf einen Fortschritt für eine Weiterdifferenzierung von Osteoblasten-ähnlichen Zellen. Aber es stabilisiert die Differenzierung von mesenchymalen Vorläuferzellen.
Frühere Studien zeigen klar, daß die Zellen von Hühner-Embryonen-Kalvaria in Chondrozyten differenziert werden können (Wong und Tuan 1995; Stringa und Tuan 1996).
Dieses chondrogene Potential besteht unter bestimmten Bedingungen, wie z.B. einer Umgebung mit wenig Kalzium (Jacenko und Tuan, 1995). Zusätzlich zu der Beobachtung der Embryonen-Kalvaria, welche ein pränatales System darstellt, stellen die aus dem Periost stammenden Osteoblasten-ähnlichen Zellen, die in dieser Arbeit verwendet wurden, einen Fall von chondrogenem Potential in vitro in einem postnatalen System dar.
Die Differenzierung der Chondrozyten ist abhängig von den strukturellen Eigenschaften der stationären Umgebung (Zell-Matix-Kontakte). Zellen in einer nicht-adhäsive Umgebung (Agarose-Gele), verhalten sich phänotypisch und biochemisch anderes als in einem adhäsiven Zustand (Kollagen I-Gel oder Monolayer-Kultur). Die Zell-Matrix- Wechselwirkung und die Bildung von geeigneten Matrix-Rezeptoren bestimmen die
Richtung der Differenzierungen.
Nach Überführung in Agarose-Kulturen verändern die Osteoblasten-ähnliche Zellen radikal ihren Phänotyp zu demjenigen von Chondrozyten. Sie nehmen eine runde Gestalt und andere ultrastrukturelle Merkmale von Knorpelzellen an und synthetisieren Kollagen II, aber nicht die Kollagene I und V, die typisch für die Osteoblasten-ähnliche Zellen sind. Die Zellen produzieren weder Kollagen X noch alkalische Phosphatase. Sie haben jedoch den Phänotyp von Chondrozyten in frühen Stadien der Reifung (Szüts u.a., 1998). Die Abschaltung der alkalischen Phosphatase-Synthese könnte sofort nach der Ablösung von Zellen stattfinden.
Die Osteoblasten-ähnlichen Zellen in Monolayer-Kulturen synthetisieren Kollagene I, V, III und alkalische Phosphatase. Die Zellen proliferieren und sehen wie die Osteoblasten aus.
Die Osteoblasten-ähnlichen Zellen lassen sich auch in Kollagcn I-Gel kultivieren. Die Zellen bleiben Osteoblasten-ähnlich und produzieren Kollagen I und V, alkalische Phosphatase und proliferieren radikal. Bemerkenswerterweise produzieren die Zellen kein Kollagen III, was als Zeichen für die eiterdifferenzierung der Osteoblasten-ähnlichen Zellen im Kollagen I-Gel gerwertet werden kann. Wir vermuten, daß die Rezeptoren von Kollagen I eine Rolle bei der Abschaltung der Kollagen III-Synthese spielen. Die Zellen in 5 Diskussion 100 Kollagen I-Gel zeigen die typischen Eigenschaften von Osteo-blasten in tieferen Zonen von Kortikal-Knochen.
Zusammengefaßt, postulieren wir schließlich, daß die Kommunikation zwischen Zellen und extrazellulärer Umgebung eine große Rolle für die Bestimmung des Knochenzellen- Phänotyps und die Differenzierung von Zellen spielt. Zusätzlich und Gegensatz zu anderen dreidimensionalen Kultur-Systemen (Attawia u.a. 1995; Laurencin u.a.1996; Saad u.a.1998; El-Ghannam u.a.1997; Schoeters u.a. 1992; Casser-Bette u.a. 1990; Tsuang u.a. 1997), erlaubt unsere Kultur die lichtmikroskopische Beobachtung von Zellen während der Kultivierungs-Periode. Daher kann diese Kulturmethode als sinnvolles 3-D-Modell für das Studium von Differenzierungs-Potentialen der osteogenen Zellen dienen.
4. Ergebnise 4.1.1.2 Die Präparation 4.1.1.3 Die Zellzahl 3 Jahre 8,000,000
10 Jahre 5,600,000 4.1.1.4 Die Vitalität 4.1.3 Gewebeuntersuchungen kultiviert. 4 Ergebnisse 71 gestellt. 4.2.1 Biochemische Analyse markiert. Alter: 5
4.2.2 Laborchemische Analyse definierten Agarosekultur gelten. Darstellung: Fluorogramm
pN-Kollagen II
Kollagen II 4.3.2.1 Morphologische Untersuchungen
i) Lichtmikroskopische Untersuchung ii) Elektronenmikroskopische Untersuchung Die Kontrastierung: 6000x 4.3.2.2 Biochemische Untersuchungen charakteristisch. ii) Elektromiskroskopische Untersuchungen Kontrastierung: 9.000 x 4.3.4.1 Morphologische Untersuchung Posted by admin @ 8:48 am
3. Material und Methode
3.1 Materialien
Lösungen und Reagenzien:
Allgemeine Reagenzien
Glycerol (ICN, Aurora, OH, USA)
Glycin Natriumlaurysulfat (SDS)
Dinatriumhydrogenphosphat Dihydrat (Roth, Karlsruhe, D)
Eisessig
Harnstoff
0,2% P-Nitrophenylphosphat (Sigma 104 Phosphatase Substrat)
Ammoniumacetat (Merck, Darmstadt, D)
Natriumhydrogenkarbonat
Salzsäure, konz.
Diethanolamin (Sigma, Deisenhofen, D)
Freud'sches Adjuvans (kompl./nichtk.)
PMSF Lösungen und Reagenzien (Zellkultur):
Krebspuffer
15,7 mM Na2HPO4,
1,6 mM KH2PO4,
111,2 mM NaCl,
5,4 mM KC1,
1,3 mM MgC1
2,4 mM NaHCO3,
13 mM Glucose,
PBS (Zellkultur)
140 mM NaCl,
8 mM Na2HPO4,
3 mM KC1,
1,5 mM KH2P04,
pH7,4
Dulbecco's modifiziertes Eagle Medium (Gibco Life Technologies,
Paisley, Schottland, Kat.-Nr.: 52100-013)
Kollagenase B aus Clostridium histolyticum, EC 3.4.24.3. (Boehringer Mannheim, D, Ka.-Nr.: 1088831)
hochschmelzende Agarose SEA KEM (FMC BioProducts Rockland, USA, Biozym, Hess. Oldendorf, D, Kat. Nr.: 50004)
niedrigschmelzende Agarose SEA USA, PLAQUE (FMC BioProducts Rockland, Biozym, Hess,
Oldendorf, D, Kat. Nr.: 50102) Penicillin,
Streptomycin (Gico Life Tehcnologies, Paisley, Schottland, Kat.-Nr.: 15140-114)
Fungizon: Amphotericin B 250 mg/ml (Gibco Life Technologies, Paisley, Schottland, Kat.- Nr.: 15290)
Fötales Kälberserum (PAA, Linz, A, Kat. Nr. : A 1 5-043)
14C-Prolin (NEN, Dreiech, D)
L-Cystein (Sigma, Deisenhofen, D)
Ascorbinsäure (Merck, Darmstadt, D)
ß-Aminopropionitril (Sigma, Deisenhofen, D)
Pyruvat (Fluka, Buchs, CH)
Insulin (bov. Pankreas) (Boehringer, Mannheim, D, Dat.-Nr.:977420)
IGF-I (Boehringer, Mannheim, D)
Storage-puffer 0,4 M NaCl, 100 mM Tris-HCL,
pH 7,4 Lösungen und Reagenzien (alkalische Phosphatase)
Reaktionslösung
0,2% p-Nitrophenylphosphat in Diethanolamin- HCl,
Stopplösung
2M NaOH,
0,2 mM EDTA
Lösungen und Reagenzien (Elektrophorese, Kollagenanalyse)
40% (w/v) Acrylamid/Bisacrylamid-Stammlösung Acrylamid/Bisacrylamid 37,5:1) (Appligene oncor, Illkirch, F)
Sammelgelpuffer (Stammlösung)
0,5 M Tris, 0,4% SDS, pH 6,8
Trenngelpuffer (Stammlösung)
Kammerpuffer
25 mM Tris, 0,1% SDS, 0,2 M Glycin
SDS-Probenpuffer:
0,1 M Tris-HCl, pH 6,8 mit 10% (w/v) Glycerol, 2% (w/v) SDS, 0,8 M
Harnstoff, 0,001% (w/v) Bromphenolblau.
Der reduzierende0 Probenpuffer enthielt 5% (v/v)
ß-Mercaptoethanol.
Entfärblösung
10% Methanol, 10% Essigsäure Pepsin (procine)
Coomassie Blue R-250 (Serva, Boehringer Ingelheim Bioproducts Partnership, Heidelberg)
Coomassie Blue-Lösung 0,1% Coomassie in 25% 2-Propanol, 10% Essigsäure
Molekulargewichtsstandard (6,4- 200 kDa) (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)
Plyklonaler Antiköper gegen Kollagen X des Huhns (Von der Mark, 1997)
Sekundärer Antikörper gegen Immunglobulin G des Kaninchens
gekoppelt mit Peroxidase (Kirgegaard & Perry Lab., WAK Chemie, Bad Homburg v.H.)
Chemoluminessenzsystem ECL (Amersham Life Science, Kat.-Nr.: 2106)
4-Chlor-l-Naphtol (Sigma, Deisenhofen, D)
Lösungen und Reagenzien (Elektronmikroskopie):
Fixierlösung
3% Paraformaldehyd,
0,4% Glutaraldehyd,
3,4% 0,1M Natriumcacodylat pH 7,4,
Osmium,
Propylenoxid
3.2 Methoden
3.2.1 Chondrozytenzellkultur
3.2.1.1 Die Isolierung von Chondrozyten aus Rippenknorpel
Der aus der Kinderchirurgie und des Rechtsmedizin erhaltene Rippcnknorpel wurde zweimal in Krebspuffer mit 100 U/ml Penicillin, 100 mg/ml Streptomycin und 2,5 mm/ml Fungizon gewaschen und von Perichondrium und Geweberesten befreit. Anschließend wurde er dreimal in Krebspuffer mit 10 U/ml Penicillin, 100 mg/ml Streptomycin und 2,5 mg/ml Fungizon gewaschen. Der gewaschene Rippenknorpel wurde quer zu seiner Längsachse ca. 0,3 mm dünn geschnitten. Der geschnittene Knorpel wurde über Nacht mit 2 mg/ml bakterieller Kollagenase in DM EM unter Zusatz von 100 U/ml Penicillin, 100 mg/ml Streptomycin und l mM Cystein im Brutschrank (37° C; 5% CO2) verdaut.
Um die Verdauung zu beschleunigen wurden die Zellen durch vorsichtiges Aufsaugen und Zurückpipettieren der Verdauungslösung suspendiert. Die Dauer des Verdauens durch die Kollagenase steigt mit dem Alter des Knorpels an. Nach der Verdauung wurde die entstandene Chondrozytensuspension durch einen 40mm Nylonfilter gegeben, um Gewebereste zurückzuhalten. Zur Vermeidung von Zellverlusten wurde die Petrischale und der Nylonfilter anschießend mit Krebspuffer gespült und die Zellsuspension auf 50 ml aufgefüllt. Sie wurde zentrifugiert ( 600 x g, 5 min, RT) und das Zellpellet erneut in 50 ml Krebspuffer resuspendiert. Insgesamt wurden die Zellen zweimal gewaschen.
Sie wurden schließlich in 10 ml Krebspuffer aufgenommen, die Zellzahl dieser Suspension wurde mit Hilfe einer Neubauer-Kammer im Phasenkontrastmikroskop bestimmt. Die Zellsuspension wurde zentrifugiert, und das Zellpellet wurde anschließend in DMEM so aufgenommen, daß die Zellzahl dieser Einzelzellsuspension auf 4×106 eingestellt wurde.
Diese Zellsuspension wurde weiter für die Agarosesuspensionskulturen verwendet.
3.2.1.2 Die Agarosesuspensionskulturen (Benya und Schaffer, 1982)
Sterile Petrischalen wurden mit einer 1% (w/v) hochschmelzendcn Agarose (in H2O) beschichtet (0,7 ml/ 35 mm Schale). Um die Agaroselösung zu sterilisieren, wurde sie autoklaviert. Dann wurden 700 ml der sterilen Agaroselösung auf dem Schalenboden verteilt. Diese Schicht ließ man bei Raumtemperatur gelieren. Zum Anlegen der Agarosesuspensionskultur wurde die Zellsupension im Verhältnis 1:1 zu einer Mischung aus gleichen Teilen zweifach konzentriertem DMEM und 2%-iger wäßriger Agarose gegeben.
Die Agaroselösung wurde autoklaviert und dann mit dem zweifach konzentrierten Medium gemischt. Zu dieser Mischung wurden die Zellsuspension, die auf die erforderliche Zelldichte eingestellt war, pipettiert. Die Schalen wurden 15 Minuten lang auf eine Wärmeplatte gestellt, um die Agarose vorläufig in flüssigem Zustand zu halten.
Dadurch sedimentieren die Chondrozyten auf die Grenzfläche der beiden Agaroseschichten. So wird die Beobachtung der Zellen im Phasenkontrastmikroskop und die Quantifizierung der Zellzahle ermöglicht. Nach erfolgter Sedimentation der Zellen wurde die flüssige Zell-Agarosemischung im Kühlschrank bei 4°C 10 Minuten lang verfestigt.
Nach dem Gelieren der Agarose wurden die Kulturen im Brutschrank (5% Kohlendioxid, 37° C) inkubiert. Das Kulturmedium wurde auf die Agarosesuspension pipettiert. Als Kulturmedium wurde DMEM verwandt, welches 60 mg/ml ß- Aminopropionitril, 25 mg/ml Ascorbat, l mM Cystein, l mM Pyruvat, 1% (v/v) Penicillin und 1% (v/v) Streptomycin enthielt. Je nach den experimentellen Bedingungen wurden Wachstumsfaktoren, fötales Kälberserum und/oder 15 mM Zinksulfat zugesetzt. Im Abstand von 3 Tagen wurde das Medium ersetzt.
3.2.1.3 Die Bestimmung der Zellvitalität mit Trypanblauausschuß
Für die Bestimmung vitaler Zellen haben wir 100 ml einer 0,5% Trypanblaulösung in PBS zum Kulturmedium pipettiert. Nachdem die Kultur für 20 Minuten im Brutschrank inkubiert worden war, wurde das Medium von der Kultur abgenommen, und die Zahl der Trypanblau negativen Zellen ermittelt.
3.2.1.4 Die Kollagenpräparation aus Knorpelzellkulturen
i) Markierung der Zellen
Die Kulturen wurden in der Regel von 15 Uhr bis 63 Uhr (für 48 Stunden) mit l mCi/ml L-[C14-U]-Prolin metabolisch markiert. Anschließend wurde entweder nur das abgenommene Medium oder die gesamte Kulturschale bei -20° C eingefroren.
ii) Isolierung der Kollagene aus der gesamten Kultur
a) Isolation der nativen Kollagene
Nach dem Auftauen der eingefrorenen Kultur wurde das abgenommene Medium in 2ml-Eppendorfgefäßen zentrifugiert (1000 x g, 15min), um die Agarose vom Medium zu trennen. Das Pellet wurde verworfen, und aus dem Überstand wurden die Kollagene bei einer Konzentration von 4,5 M NaCl ausgefällt. Man gab langsam festes NaCl bis zu einer Konzentration von 4,5 M zu, rührte für 6 Stunden und zentrifugierte (RPM 14000, F2402, 30min, 4° C, 17530g) die präzipitierten Kollagene ab. Der Überstand wurde verworfen. Das Pellet wurde in 300 ml Storage-Puffer (0,4 M NaCl, 0,1 M Tris-HCl, pH 7,4) aufgenommen. Die Kollagene wurden mit 1700 ml Ethanol präzipitiert, abzentrifugiert (F2402, 17530 x g, 20 min, 4° C) und in deionisiertes Wasser aufgenommen. Nach 2 mal wiederholter Ethanolpräzipitation wurden die Kollagene in 100 ml Probenpuffer aufgenommen.
b) Isolation der Pepsin-resistenten Kollagene
Nach dem Auftauen wurde die zellhaltige Niedertemparatur-Agarose von der Hochtemperatur-Agarose getrennt. Die Hochtemperatur-Agarose wurde verworfen. Die Niedcrtemperatur-Agarose wurde in Zentrifugenröhrchen (Beckman) überführt, mit dem Medium der Kulturschale vereinigt und für den limitierten Pepsinverdau mit 5ml einer Pepsinlösung (l mg/ml Pepsin in 0,5 M Essigsäure, 0,4 M NaCl) versetzt. Diese Lösung wurde 72 Stunden bei 4° C gerührt, anschließend mit 500 ml l M Tris-Lösung (ungepuffert) versetzt und mit 10 M NaOH zum Umschlagspunkt von Phenolrot neutralisiert.
Durch Zugabe von festem NaCl wurde eine Konzentration von l M NaCl eingestellt. Diese Lösung wurde zur vollständigen Extraktion der Kollagene bei 4° C über Nacht gerührt und anschließend zur Abtrennung von Zelldebris und Agarose zentrifugiert (JA 20,1, 28980 x g, 4° C, 30 min). Da frühere Studien (Shaffer, 1982; Bruckner et al., 1989) ergeben hatten, daß diese Fraktion kein nachweisbares Kollagen mehr enthält. Das Pellet wurde verworfen, und die Kollagene wurden durch Erhöhen der NaClkonzentration von 4,5 M NaCl ausgefällt. Dazu wurde festes NaCl in die Lösung gegeben (200 mg/ml).
Die Lösung ließ man für 4 Stunden bzw. über Nacht rühren. Die ausgefallenen Kollagene wurden abzentrifugiert (F2402, RPM 14000, 17530 x g, 20 min, 4°C). Das Pellet wurde in 300 μl Storage-Puffer (0,4 M NaCl, 100 mM Tris-HCl, pH 7,4) aufgenommen und in einem 2ml Eppendorf überfuhrt. Die Kollagene wurden mit 1700 μl Ethanol präzipitiert, abzentrifugiert (F2402, 17530 x g, 20 min, 4°C) und das Pellet in bidestilliertcs Wasser aufgenommen. Nach wiederholter Ethanolpräzipitation wurden die Kollagene in 100 μl Probepuffer aufgenommen. Die Kollagene wurden mit 5 μl Mercaptoethanol reduziert.
3.2.1.5 Die Bestimmung der Zellproliferation
Für die Bestimmung der Zellproliferation wurde nach bestimmten Zeitintervallcn dieselbe Stelle der Kulturschale (sichtbar gemacht durch einen kleinen Punkt am Boden der Petrischale) durch ein Phasenkontrastmikroskop vergrößert und fotografiert (Zeiss Axiowert)
10). Die Anzahl der Zellen auf den Aufnahmen (mindestens 100 Zellen) wurden über die ganze Kulturzeit verfolgt und durch Zählen bestimmt.
3.2.1.6 Nachweis der alkalischen Phosphatase
Der Nachweis der alkalischen Phosphatase wurde durch deren Reaktion von mit p- Nitrophenylphosphat erbracht (Bessey et al., 1946). Die Aktivität in den Medienüberständen blieb auch nach längerer Lagerung bei -20° C erhalten. 50 μl Aliquots des Medienüberstands im Eppendorfgefäß wurden mit 450 μl einer Reaktionslösung (0,2% p- Nitrophenylphosphat in Diethanolamin-HCl, pH 9,8) versetzt.
Im Brutschrank wurden die Ansätze bei 37° C für 30 min inkubiert und anschließend mit einer Stopplösung (2M NaOH, 0,2 mM EDTA) versetzt. Bei einer Wellenlänge von l = 405 nm wurde die Extinktion des gelben Reaktionsprodukts (P-Nitrophenol) bestimmt.
3.2.1.7 Elektrophorese, Autoradiographie, Western-Blot
i) Elektrophorese
Die im Probepuffer für 3 min bei 95° C denaturierten Proteine wurden auf Polyacrylamidgradientengelen elektrophoretisch getrennt (Laemmli, 1970). Zur Analyse der Kollagene wurden die Kollagen im Probepuffer (0,8 M Harnstoff, 10% (w/v) Gly-cerol, 2% (w/v) SDS, 0,001% (w/v) Bromphenol Blau, 0,1 M Tris-HCl, pH 6,8) aufgenommen und durch 4,5-15% Polyacrylamidgradientengelen getrennt. Die Anfärbung der Proteine erfolgte in einer wäßrigen Lösung mit 0,1% (w/v) Coomassie Brillant Blue R-250 in 25% (v/v) 2- Propanol, 10% (v/v) Essigsäure, die Entfärbung der Gele erfolgt in 10% (v/v) Essigsäure, 10% (v/v) Methanol.
ii) Autoradiographie (Bonner and Laskey, 1974)
Nach der Färbung mit Coomassieblau wurden die Gele für die Fluorographie vorbereitet, indem sie dreimal für je 15 Minuten in Dimcthylsulfoxid (DMSO) äquilibriert und danach für 2 Stunden in 20% (W/V) Diphenyloxazol (l DPO)/DMSO) getränkt wurden.
Die behandelten Gele wurden ausgiebig gewässert und anschließend ge trocknet.
Die Exposition der Gele erfolgte bei -80° C auf Kodak XAR-5 Röntgenfilmen.
iii) Imiminblot
Die elektrophoretisch aufgetrennten Proteine wurden im Immunblot auf eine Nitrocellulose-Membran elektrotransferiert (Towbin et al., 1979).
Dazu wurden das PA-GEGel und die Nitrocellulosemembran mit Filterpapieren und Schwammtüchern zwischen Gitter geklemmt und in einen Tank zwischen zwei Plattenelektroden getaucht, der mit Blotpuffer (50 mM Tris, 3580 mM Glycin, 0,1% (w/v) SDS, 20% (v/v) Methanol) gefüllt war. Bei einer Spannung von 30V und einer Stromstärke von 490 mA wurden die Proteine für 6 Stunden elektrotransferiert.
Soweit notwendig wurden transferierte Proteine auf der Membran mit 0,1% (w/v) Coomassie Blue R-250 in 40% (v/v) Methanol, 1% (v/v) Eisessig für l Minuten gefärbt und mit 50% (v/v) Methanol entfärbt. Die Blotmembran wurde zur Blockierung unspezifischer Bindungsstellen nach dem Transfer mit 2% Trockenmilchpulver in PBS behandelt und über Nacht bei 4°C unter Schütteln mit dem primären Antikörper in entsprechender Verdünnung in 0,5% Trockenmilchpulver in PBS inkubiert. Die Membran wurde nach mehrfachem Waschen mit PBS mit dem zweiten Antikörper gegen IgG des Kaninchens in 0,5% Trockenmilchpulver in PBS 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Immunreaktive Banden wurden nach intensivem Waschen mit einem Chemolumineszen/system oder unter Verwendung einer Substratlösung aus 0,18 mg/ml 4-Chlor-l-Naphtol und 0,04% H2O2 delektiert.
3.2.1.8 Elektronenmikroskopie
a) Präparation
Für elektronenmikroskopische Untersuchungen wurden die Agarosekulturen folgendermaßen vorbereitet: Ein Stück Kultur, bestehend aus Hoch- und Niedertemperaturagarose, wurde 4 Stunden lang bei 4°C in 3% Glutaraldehyd/ 0,1 M Natriumcacodylat pH 7,4 fixiert. Nach Waschen mit PBS pH 7,4 wurde es für l Stunde bei Raumtemperatur mit Osmium inkubiert und dann in einer aufsteigenden Alkoholreihe entwässert (15 min Leitungswasser, 15 min 70% EtOH, 15 Minuten 90% EtOH, 15 min 96% Ethanol, 2 x 25 min EtOH abs.). Danach wurde das Stück 2×15 min in Propylenoxid gelegt und dann über Nacht bei 4° C in ein Eponpropylenoxid-Gemisch gegeben. Nach Einbettung in Epon (3 Tage im Wärmeschrank bei ca. 65°C zur Polymerisierung) wurden Semidünnschnitte und Ultradünnschnitte am (Ultra)-Mikrotom angefertigt.
b) Elektronenmikroskopische Untersuchungen Das verwendete Transmissionselektronenmikroskop Zeiss EM902 ist ein TEM mit einem zwischen dem ersten und zweiten Projektivlinsensystem integrierten Castaing-Henry- Energiefilter.
Es hat ähnliche Abbildungseigenschaftcn wie ein konventionelles TEM mit den Vorteilen verbesserter Bildkontraste im Abbildungs- und Beugungs-Modus bei der sogenannten zero-loss Filterung. Hierbei wird in Näherung die chromatische Aberration durch Ausfilterung unelastisch gestreuter Elektronen unterdrückt und damit der Kontrast und die laterale Auflösung erhöht. Eine weitere Kontrastierung (z.B. mit Uranylazetat) und damit eine weitere Manipulation des nativen Zustands der Proben war daher nicht mehr notwendig. Parallel zur Morphologie wurde auch die strukturelle Ausprägung und Anordnung der ersten Mineralbildungen durch zero-loss gefilterte Elektronenfeinbereichsbeugung untersucht.
Durch die Tatsache, daß bei elektronenmikroskopischer Beugung eine sehr viel geringere Anzahl periodisch wiederkehrender atomarer Baugruppen im Kristallgitter zur Erzeugung elektronenmikroskopischer Beugungsreflexe gegenüber der Röntgenbeugung ausreicht, und durch 3 Material und Methoden 50 die Erhöhung des Kontrastes aufgrund der zero-loss Filterung, konnte die Anordnung und strukturelle Ausprägung der primären Kristallbildungen bei den Matrix-vesikeln weitgehend geklärt werden. (Mit Dank an Dr. U. Plate für die elektronenmikroskopischen Untersuchungen).
3.2.1.9 Der Gewinn von Osteoblasten-ähnlichen-Zellen
Die primären osteogenen Vorläuferzellen wurden aus Kälberpriost gewonnen. Hierzu wurde das Periostgewebe des Methacarpus frei präpariert und dann vorsichtig von Knochen abgelöst. Schmale Stücke mit einer Fläche von 0,5 x 1cm wurden geschnitten und mit der osteogenen Seite nach unten in Kulturschale (etwa 10 Stück proSchale) verteilt. Die Explantate wurden in DMEM mit 75/L Glutamin, 10% FKS, Penicillin 100 μg/ml, Streptomycin 100 μg/ml, unter Zusatz von 50 μg/ml Betaaminopropionitrite (BAPN), 50 μg/ml Ascorbat, 1 mM Cystein und 1 mM Pyruvat bei 37°C und 5% CO2 kultiviert. Das Medium wurde 1 x pro Wochen gewechselt. Nach 4 Wochen sind Osteoblasten-ähnlichen Zellen aus dem Perioststück ausgewachsen und können für weitere Versuche verwendet werden. Hierzu wurden die Zellen durch Inkubation mit Kollagenase und Tyrode-Lösung abgelöst, gesammelt und mit 500 g/min zentifugiert. Das so gewonnene Zellpellet wurde für weitere Untersuchungen eingesetzt. (Mit Dank an H, P. Wiesmann für den Gewinn der Osteoblasten-ähnlichen Zellen).
3.2.1.10 Die Kultivierung der Osteoblasten-ähnlichen-Zellen in Kollagen I-Gel
Für das Anlegen der Zellkulturen wurde eine Lösung von 5 mg/ml Kollagen I in 10 mM Salzsäure hergestellt. Diese Lösung wurde zur Sterilisation gegen 10 mM HCl mit 0,5% Chloroform dialysiert. Durch häufiges Redialysieren gegen 10 mM HCl wurde das Chloroform entfernt. Die Schalenböden wurden mit einer Trägerschicht bedeckt, die ebenfalls aus einem Kollagen I-Gel bestand. Dazu wurde die Kollagenlösung mit der gleichen Menge zweifach konzentrierten Mediums und einer entsprechenden Menge normalen DMEM gemischt, so daß eine Kollagenkonzentration von 1,2-1,25 mg/ml eingestellt wurde. In die Schalen wurden jeweils etwa 800 μl der Lösung pipettiert. Die Schalen wurden über Nacht im Brutschrank inkubiert, so daß sich ein festes Trägergel bildete.
Zum Anlegen der Kulturen wurde die Kollagenlösung mit der gleichen Menge zweifach konzentrierten DME Mediums gemischt. Dieser Lösung wurde die entsprechende Menge der Zellsuspension zugegeben, so daß die Zellzahl 2×106 Zellen/ml in der fertigen Suspension betrug. In jede Kulturschale wurden 800 μl der Suspension pipettiert. Die Kollagenkonzentration in der Gelmatrix betrug 1,2 oder 1,25 mg/ml. Die Kollagene ließ man im Brutschrank über Nacht zu einem festen Gel erstarren.
3.2.2.1 Die Isolation von denaturierten Kollagenpolypeptide aus dem Rippenknorpel
2g Rippenknorpel wurde der von Perichondrium und anderem Fremdgewebe befreit, dreimal mit Krebspuffer gewaschen, in 0,3 mm dicke Scheiben geschnitten und in 20 ml 50 mM Tris, 4,5 M Guandinin, 5mM EDTA, 5mM Benzamid, 5mM N-Ethyl-Maleimide, pH 7,4 inkubiert. Danach erfolgt eine Homogenisation mit einem Polytron-Homogenisator.
Die entstehende Suspension wurde in einem 50 ml Falcontube bei 4° C geschüttelt. Nach 24 Stunden Schütteln wurde die Suspension zentrifugiert. Der Überstand der Rohkollagenlösung wurde dreimal gegen das 20-fache Volumen von DEAE-Puffer (2 M Harnstoff, 0,2 M NaCl, 0,1 M Tris-HCl, pH 7,4) dialysiert und anschließend auf 40 ml verdünnt. Nach dem Zentrifugieren (JA 30.50, 15000 rpm, 4° C, 15 min, 27200 x g) wurde 200 μl Kollagenlösung mit 1800 μl Alkohol bei 4°C 3 Stunden präzipitiert, abzentrifugiert (F2402, 17530 x g, 20 min, 4 °C) und das Pellet in bidestilliertes Wasser aufgenommen. Nach wiederholter Ethanolpräzipitation wurden die Kollagene in 100 μl Probepuffer aufgenommen. Die Kollagene wurden mit 5 μl Mecaptoethanol reduziert.
Der Knorpel wurde mit Krebspuffer gewaschen und von Perichondrium und Fremdgewebe befreit. Der so erhaltene Knorpel wurde dünn (ca. 0,3 mm) geschnitten und in 3% Glutaraldehyd/ 0,1 M Natriumcacodylat, pH 7,4 fixiert. Die weiteren Schritte erfolgten parallel zur bereits oben beschriebenen Elektronenmikroskopie der Agarosekulturen.
3.2.2.3 Präparation von säurelöslichem Kollagen I aus Kalbshaut
Bei -80 °C gelagerte, fötale Kalbshaut wurde auf Eis gestellt, in 5 cm breite Streifen geschnitten und unter Zugabe von gestoßenem Eis im Fleischwolf zerkleinert.
Die Haut wurde mit kaltem Wasser aufgeschlämmt und anschließend abzentrifugiert (JA 10, 17696 x g, 30 min, 4 °C). Das Pellet (270 g) wurde mit 111 M NaCl, 50 m M Tris-HCl, pH 7,4, 20 mM EDTA, 2 mM N-Ethylmaleinmid durch ein mechanisches Rührwerk extrahiert. Die Extraktionslösung wurde zentrifugiert (JA 10, 17696 x g, 30 min, 4 °C), und der Überstand der Neutralsalzextraktion wurde aufgehoben.
Das Pellet wurde mit 1500 ml 0,5 M Essigsäure versetzt und durch Rühren mit einem mechanischen Rührwerk extrahiert. Durch Zentrifugation (JA 10, 17696 x g, 30 min, 4 °C) wurde säurelösliches Kollagen im Überstand erhalten. Dieser Überstand (1500 ml) wurde durch langsames Einstreuen mit 78,9 g festem NaCl versetzt, sodaß eine Endkonzentration von 0,9 M NaCl erreicht wurde. Die Lösung ließ man zur vollständigen Fällung weitere 6 Stunden bei 4 °C rühren. Diese Lösung wurde zentrifugiert (JA 10, 17696 x g, 30 min 4 °C).
Das Pellet, das die Kollagene I, III und V enthält, wurde mit 3000 ml 0,5 M NaCl, 0,1 M Tris, pH 10,5 versetzt und mit dem Polytron homogenisiert. Das Homogenat wurde durch Zusatz von 2 ml 8 M HCL auf pH 7-8 gebracht und weiter gerührt. Die Lösung wurde zentrifugiert (JA 10, 17696 x g, 30 min, 4 °C).
Der Überstand (315 ml) wurde durch langsames Eintragen von 22,1 g festem NaCl in die Lösung auf eine Konzentration von 1,7 M NaCl gebracht. Die Lösung wurde über Nacht bei 4 °C gerührt, und anschließend wurden weitere 300 ml des Puffers mit 1,7 M NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4 hinzugefügt. Die Lösung wurde zur Abtrennung von Kollagen III zentrifugiert.
Der Überstand wurde mit 1,7 M NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4 auf das doppelte Volumen verdünnt und mit Eisessig auf pH 2-3 eingestellt. Die Lösung wurde durch Zentrifugation geklärt (JA 10, 17696 x g, 30 min, 4 °C). Diese Lösung wurde dreimal gegen 210,2 M Essigsäure dialysiert und anschließend lyophilisiert. Aus der Präparation wurden 1,7 g säurelösliches Kollagen I erhalten.
3.2.3 Zink-Bestimmung nach ICP-ms-Methode und DNA Bestimmung
Die aus dem Rippenknorpel isolierten zwei Millionen Zellen wurden erst im deionisiertem Wasser aufgenommen. 100 μl dieser Suspension (entspricht 200 Tausend Zellen) wurden für DNA-Bestimmung und 900 μl für die Bestimmung der Ionenzusammensetzung durch Inductively Coupled Plasma-mass spectrometry (ICP-MS) verwendet. Die ICP-MS hat Dr. Peter Quint in Institut für Medizinische Physik und Biophysik für uns durchgeführt.
3.2.3.1 Fluorimetrische DNA-Bestimmung
Die l00 μl Probe (etwa 200 Tausend Zellen) wurden in 1,4 ml l0 mM Tris/HCl, pH 7,0, 10 mM NaCl aufgenommen. Die Zellen wurden bei -80 °C eingefroren und nach 4 Stunden wieder aufgetaut. Die aufgetauten Zellen wurden noch weiter mit Ultraschall 5 Minuten behandelt und mit 0,2mg Bisbenzimid versetzt.
Je 10 μl der drei DNA-Standard(l) und 10 μl H2O (Leerwert) wurden mit 1,5 ml Farbstofflösung(2)versetzt. Im Fluorimeter wurden nach 5-60 Minuten mit einer Anregungswellenlänge von ca. 365nm die Emissionen der Ansätze im Bereich um 450nm gemessen.
Aus den Emissionen und Konzentrationen der Standards wurde eine Eichkurve erstellt, mit deren Hilfe die Konzentration der Proben ermittelt wurde.
1. DNA-Standards: l,5 μg/ml, 1 μg/ml, 0,5 μg/ml
2. Farbstofflösung: 0,2 mg Bisbenzimid (Hoechst 33258)/1 in 10 mM Tris/HCl, pH 7,0, l0 mM NaCl
3. Eichstandard für das Fluorimeter