Refine Faculty / Organisational entity Fachbereich Biologie (91) Al-Zereini Wael (1)
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91 search hits Year Year Title Title Author Author Charakterisierung der Polytänchromosomen aus dem Embryosuspensor von Phaseolus coccineus L.
Mario Nenno
Versuche zur neuronalen Basis kontextabhängiger Antworten im Femur-Tibia-Kontrollsystem der Stabheuschrecke
Wolfgang Stein
Mechanismusorientierte Untersuchungen zur anti-neoplastischen Wirkung von Naturstoffen und Naturstoffderivaten
Ellen Niederberger
In der vorliegenden Arbeit wurden Wirkstoffe aus unterschiedlichen Substanzklassen auf ihre antineoplastische Aktivität an humanen Tumorzellinien untersucht. Einige der getesteten Substanzen zeigten gute Ansätze für einen möglichen späteren Einsatz in der Tumortherapie. Die Alkaloide Lycorin und Lycobetain zeigten im Sulforhodamin B-Assay eine sehr gute Wachstumshemmung. Der IC50-Wert der Substanzen lag bei allen getesteten humanen Tumorzellinien unter 3 microM. Trotz der hervorragenden Wachstumshemmung konnte für Lycorin kein Wirkmechanismus gefunden werden. Ein Arrest der Zellen in der G2/M-Phase des Zellzyklus konnte jedoch gezeigt werden. Für Lycobetain kristallisierte sich eine duale Hemmung von Topoisomerase I und II als möglicher Wirkmechanismus heraus. Die Aktivität von Topoisomerase II konnte durch 100 microM Lycobetain vollständig inhibiert werden. Bereits bei 10 microM Lycobetain war keine Topoisomerase I Aktivität mehr detektierbar, was nachweislich auf der Stabilisierung des DNA-Topoisomerase-Komplexes beruhte. Diese resultierte in einer Induktion von DNA-Strangbrüchen, Arrest der Zellen in der G2/M-Phase des Zellzyklus und schließlich der Induktion von Apoptose. Alle diese Eigenschaften deuteten auf eine Topoisomerase-Hemmung als Wirkmechanismus von Lycobetain hin. Untersuchungen von fünf Flavonoiden aus der chinesischen Heilpflanze Scutellaria baicalensis zeigten, daß Baicalin, Baicalein, Skullcapflavon II und Wogonin das Wachstum verschiedener humaner Tumorzellinien hemmten, während Wogonosid bis zu Konzentrationen von 100 microM keine Wirkung zeigte. Baicalein und Baicalin wiesen trotz großer Strukturübereinstimmung keinen einheitlichen Wirkmechanismus auf. Baicalein hemmt, wie Lycobetain, die Aktivität der Topoisomerasen I und II, wobei für Topoisomerase I eine Stabilisierung des binären Intermediates von Topo-isomerase und DNA nachgewiesen werden konnte. Im Gegensatz zu Lycobetain interkaliert Baicalein nicht in doppelsträngige DNA, kompetiert jedoch mit dem Hoechst-Farbstoff H33258 um die Bindung an die kleine Furche der DNA. Die Induktion von DNA-Strangbrüchen, sowie der Arrest der Zellen in der G2/M-Phase des Zellzyklus und die Induktion von Apoptose konnten auch für Baicalein gezeigt werden. Messungen mit Baicalin ergaben keinen Hinweis auf Hemmung von humanen Topoisomerasen. Zellzyklusanalysen zeigten einen Arrest in der G0/G1-Phase, was im Gegensatz zu Baicalein auf einen völlig unterschiedlichen, bisher nicht geklärten, Mechanismus hindeutet. Skullcapflavon II hemmte Topoisomerase I und II ab Konzentrationen von 100 microM. Die Stabilisierung des DNA-Topoisomerase-Komplexes konnte jedoch für diese Substanz nicht nachgewiesen werden. Aufgrund der Struktur könnte jedoch auf einen anderen Mechanismus der Topoisomerase-Inhibierung, möglicherweise die Bindung an die freie Topoisomerase I und die damit verbundene Hemmung der Komplexbildung, geschlossen werden. Für Wogonin konnte in dieser Arbeit kein Wirkmechanismus gefunden werden. In unserer Arbeitsgruppe wurden verschiedene indigoide Bisindole synthetisiert [Hössel, 1996; Hössel, nicht veröffentlicht], die ebenfalls auf ihre antineoplastische Wirkung untersucht wurden. Ein großes Problem stellte dabei die schlechte Löslichkeit dieser Substanzklasse dar. Der Vergleich der Substanzen im Sulforhodamin B-Assay an der Zellinie LXFL529L ergab sehr unterschiedliche Ergebnisse. Indirubin und 5-Jod-Indirubin waren die besten Wachstumshemmstoffe mit IC50-Werten unter 10 microM. Die indigoiden Bisindole besaßen die Fähigkeit in Doppelstrang-DNA zu interkalieren und an die kleine Furche der DNA zu binden, während dies für Deoxytopsentin nicht nachzuweisen war. Im Tubulinpolymerisationsassay hemmten Indirubin, 5-Jod-Indirubin und Bisindolylindol die Polymerisation von Tubulinmonomeren. Im Vergleich zur Referenzsubstanz Colchicin war diese Hemmung jedoch für die Wirkung der Substanzen nicht von Bedeutung. Messungen zur Hemmung der cyclinabhängigen Kinase 1 (cdk1) weisen darauf hin, daß die indigoiden Substanzen ein inhibitorisches Potential für Zellzykluskinasen besitzen. Neben cdk1 hemmen Indirubin und 5-Jod-Indirubin unter anderem cdk5, eine Kinase, die an Mikrotubuliproteinen assoziiert vorliegen kann. Mittels Western-Blotting konnte gezeigt werden, daß die eingesetzte Tubulinpräperation cdk5 enthält. Die geringfügige Hemmung der Tubulinpolymerisation läßt sich möglicherweise durch die Hemmung von mit Tubulin assoziierter cdk5 erklären. Aus dem Labor von Stalina Melnik, Moskau, Rußland wurden unserer Arbeitsgruppe 13 Wirkstoffe zur Untersuchung zur Verfügung gestellt. Bei den Substanzen handelte es sich um Indolocarbazole und Bisindolylmaleimide, die sich durch verschiedene Zuckersubstitutionen an R1 sowie verschiedene Reste an X und R2 unterschieden. Im Sulforhodamin B-Assay konnte mit Ausnahme der Substanzen 1 und 11 für alle Substanzen ein IC50-Wert unter 10 microM ermittelt werden, was auf eine hohe wachstumshemmende Potenz hinweist. Wegen der Strukturähnlichkeit mit Staurosporin wurde zunächst die Inhibierung der Proteinkinase C überprüft. Am isolierten zytosolischen Extrakt konnte, ebenfalls mit Ausnahme der Substanzen 1 und 11, eine Hemmung der PKC nachgewiesen werden, wobei sich die IC50-Werte zwischen 0,4 und 34 microM bewegten. Im Gegensatz dazu waren nur zwei Substanzen (4 und 10) in der Lage in der Zellkultur die PKC-Aktivität im niedrigen Konzentrationsbereich zu hemmen. Bei den Substanzen 2 und 5 war ein IC50-Wert ermittelbar, der aber mindestens zehnfach höher lag als bei der Messung am isolierten Enzym. Eine mögliche Erklärung für dieses Phänomen ist, daß die Substanz das Zielprotein in der Zelle nicht erreichen kann. Die Strukturverwandschaft mit den Topoisomerase-Inhibitoren NB 506 und Rebeccamycin, deutete auf humane Topoisomerasen als potentiellen Angriffspunkt der Wirkstoffe hin. Tatsächlich erwiesen sich mehrere Substanzen als mögliche Hemmstoffe von Topoisomerase I und/oder II (siehe Tabelle 13). Ein weiteres Phänomen war die Fähigkeit aller Substanzen, sich an die kleine Furche der DNA anzulagern, während keine Interkalationsfähigkeit nachweisbar war. Die Induktion von Strangbrüchen war lediglich für die Substanzen 4 und 8 im unteren mikromolaren Bereich nachweisbar, während die meisten erst ab 50 microM DNA-Schäden induzierten. Die beste Wirkung zeigten aber auch diese Substanzen bei Untersuchungen zur Hemmung von cyclinabhängigen Kinasen. Dabei muß berücksichtigt werden, daß es sich bei der cdk1 um ein isoliertes Enzym handelt und die Hemmung im zellulären System möglicherweise nicht meßbar ist. Aufgrund der in dieser Arbeit erhaltenen Daten konnte für drei Indolocarbazole ein potentieller Wirkmechanismus gefunden werden. Für Substanz 8 ist die Hemmung von Topoisomerasen ein möglicher Wirkmechanismus, während Substanz 10 sich als möglicher Proteinkinase C-Hemmstoff herausstellte. Substanz 4 scheint einen potentiellen cdk1 Hemmstoff darzustellen.
Apoptosebestimmung mittels 2-Parameter-Durchflußzytometrie, Agarose-Gelelektrophorese und Fluoreszenzmikroskopie nach Induktion durch alpha,beta-ungesättigte Aldehyde und Ketone
Anja Genzlinger
In dieser Arbeit wurde die Induktion von Apoptose durch vier a,b-ungesättigte Aldehyde und ein zyklisches Keton untersucht. Die Apoptoseinduktion wurde mittels 2-Parameter-Durchflußzytometrie (DNA-/Proteinmessung), Fluoreszenzmikroskopie und DNA-Isolation bestimmt. Es wurden dazu Konzentrationskinetiken (0 bis 150microM) und Zeitkinetiken (1h-Inkubation mit anschließender Postinkubation bis 24h bzw.72h bei Molt4; 0h bis 24h bei 2-Cyclohexen-1-on) an den humanen Zellinien U937, HL-60, K562 und Molt4 aufgestellt. Bei den Zellinien U937 und HL-60 konnte die induzierte Apoptose sowohl quantitativ (durchflußzytometrisch und morphologisch) als auch qualitativ (DNA-Leiter) eindeutig bestimmt werden. Für alle Verbindungen wurde eine dosis- und zeitabhängige Induktion von Apoptose detektiert. Darüberhinaus lieferte die morphologische Analyse Informationen über die Verteilung der einzelnen Apoptosestadien. Die Zellinien K562 und Molt4 zeigten keine so deutliche Übereinstimmung zwischen den 3 Detektionsmethoden. Für die Zellinie K562 ergab sich in den eingesetzten Konzentrationsbereichen nur bei 2-Cyclohexen-1-on durchflußzytometrisch eine dosis- und zeitabhängige Apoptoseinduktion, die sich zwar mit der Analyse der DNA-Leiter, nicht aber mit der morphologischen Auswertung bestätigen ließ. Für trans-2-Hexenal und trans-2-Octenal konnte nur zeitabhängig ein Anstieg mittels FCM detektiert werden, der nur für trans-2-Octenal signifikant war. Bei beiden ergab sich keine DNA-Leiter. Die morphologische Analyse für trans-2-Hexenal ließ einen ebenfalls nicht signifikanten Anstieg erkennen. Für trans-2-Octenal wurde keine morphologische Analyse durchgeführt. Die Zellinie Molt4 zeigte nur zeitabhängig für trans-2-Hexenal, 2-trans,4-trans-Hexadien-1-al und 2-trans,6-cis-Nonadienal eine Apoptoseinduktion, die ausschließlich für 2-trans,4-trans-Hexadien-1-al signifikant war. Die Analyse der DNA-Leiter war auch hier in allen Fällen negativ. Die morphologische Analyse konnte für 2-Cyclohexen-1-on zusätzliche, im FCM nicht detektierte Apoptose zeigen. Der Vergleich der 1-Parameter-Messung des DNA-Gehaltes mit der 2-Parameter-Messung des DNA- und Proteingehaltes der Zellinie U937 bei trans-2-Hexenal- und 2-Cyclohexen-1-on-Behandlung ergab zusätzliche, bei der 1-Parameter-Messung ?versteckte" apoptotische Zellen. Diese waren eindeutig bestimmten Zellzyklusphasen zuzuordnen. Ein weiterer Vergleich der DNA-/Proteinmessung mit der als spezifischste Methode geltenden Markierung der Strangbrüche mit fluoreszenzmarkierten Nukleotiden wurde durchgeführt. Dazu wurden Beispiele aus der Literatur eingesetzt. Dieser Vergleich zeigte, daß bei einem geeigneten Zellsystem die zellzyklusspezifische Apoptosebestimmung vergleichbar war. Von Vorteil für die DNA-/Proteinmessung war dabei die einfache und kostengünstige Durchführung.Der zur Überprüfung der Diskrepanzen zwischen den Detektionsmethoden bei den Zellinien K562 und Molt4 eingesetzte Annexin V-Assay bot in beiden Fällen keine weitere Information. Die eingesetzten Methoden konnten also bei den Zellinien U937 und HL-60 in guter Übereinstimmung Apoptose detektieren, die Zellinien K562 und Molt4 zeigten sich aufgrund fehlender Fragmentierung der DNA in 180bp-Fragmente und der relativen Apoptoseresistenz von K562 für dieses Screening als ungeeignet. Für diese Zellinien müßten weitere Methoden, die nicht auf der Fragmentierung der DNA beruhen, eingesetzt werden.Aufgrund der Tatsache, daß die Apoptoseinduktion bei den Zellinien K562 und Molt4 erst nach längerer Inkubationsdauer auftrat, wurde diese als verzögerte Apoptose interpretiert. Im Vergleich dazu handelte es sich bei den Zellinien U937 und HL-60 um frühe Apoptose. Setzt man die Apoptoseinduktion mit der Phasenspezifität der Verbindungen in Beziehung, so kann man für die Zellinien U937 und HL-60 nach Inkubation mit den untersuchten Aldehyden von Homo-Zyklus-Apoptose, mit 2-Cyclohexen-1-on von Homo-Phase-Apoptose sprechen, obwohl letztere durchflußzytometrisch erst nach 12h in Erscheinung trat. Für die Zellinien K562 und Molt4 handelte es sich bei allen Verbindungen um post-mitotische-Apoptose. Die Aldehyde zeigten bezüglich ihrer Apoptoseinduktion bei U937 und HL-60 keine Phasenspezifität, es waren alle Zellzyklusphasen betroffen. Bei K562 zeigten sie G1-Phasenspezifität, bei Molt4 G1- und teilweise G2-Phasenspezifität. 2-Cyclohexen-1-on ergab S-Phasenspezifität bei U937 und HL-60 sowie G1-Phasenspezifität bei K562. Außerden trat im Zeitverlauf für trans-2-Hexenal, 2-trans,4-trans-Hexadien-1-al, trans-2-Octenal und 2-Cyclohexen-1-on ein G2/M-Arrest auf, 2-trans,6-cis-Nonadienal erzeugte einen G1-Arrest.Der Einfluß der Kettenlänge und Anzahl der Doppelbindungen auf das apoptoseinduzierende Potential wurde an den Zellinien U937 und HL-60 für trans-2-Hexenal, 2-trans,4-trans-Hexadien-1-al, trans-2-Octenal und 2-trans,6-cis-Nonadienal untersucht. Dabei ergab sich ein substanzabhängiger Anstieg der Apoptoseinduktion mit steigender Kettenlänge, der aber nicht in allen Fällen signifikant war. Der Einfluß der Doppelbindungen konnte nur im direkten Vergleich von trans-2-Hexenal und 2-trans,4-trans-Hexadien-1-al betrachtet werden. Hier trat kein signifikanter Unterschied zwischen den beiden Verbindungen auf, was wahrscheinlich auf die Konjugation der Doppelbindungen und die damit verbundene erhöhte Polarität und gleichzeitig erniedrigte Lipophilie zurückzuführen war.
Die Prämature Chromosomenkondensation (PCC) - Untersuchungen zum Einsatz in der Mutagenitätstestung
Eva Ritter
In dieser Arbeit wurde die Wirkung der a,b-ungesättigten Aldehyde Crotonaldehyd (CA), trans-2-Hexenal (HX), und des N-Nitrosodiethanolamin (NDELA) untersucht. Als Kontrollsubstanzen wurde das als Aneugen bekannte Diethylstilbestrol (DES) und die als Klastogene bekannten Mutagene Mitomycin C (MMC) und Bleomycin (BLM) eingesetzt. Es wurde die Technik der vorzeitigen Chromosomenkondensation (PCC) an unstimulierten Lymphozyten in der G0-Phase eingesetzt, die für 1 Stunde mit dem jeweiligen Mutagen inkubiert worden waren. Das Ausmaß der mutagenen Schädigung bei den PCCs wurde lichtmikroskopisch durch Auszählen von Chromatinelementen analysiert. Ze llen mit mehr als 46 Chromatinelementen wurden als geschädigt gewertet. Die Resultate der PCC-Studien wurden mit den Ergebnissen aus 48 Stunden-Metaphasenkulturen verglichen. Mit der Fluoreszenz plus Giemsa (FPG)-Technik wurden die Mitosen, die zum erstenmal nach Mutagenapplikation das Metaphasestadium erreicht hatten, identifiziert. Die Metaphasenanalyse aus 48 Stunden-Kulturen zeigte für CA bei 60microM und für HX bei 100microM eine schwach signifikante Erhöhung der Anzahl aberranter Metaphasen. Die für CA zusätzlich durchgeführten 73 Stunden-Kulturen, bei denen die Mutagenbehandlung erst 48 Stunden nach Kulturansatz durchgeführt wurden, ergab ab 240microM eine schwach signifikante Erhöhung aberranter Metaphasen im Vergleich zu unbehandelten Lymphozyten. Die Analyse der Metaphasen aus 48 Stunden-Kulturen nach NDELA-Behandlung ergab, daß sich die Zahl der aberranten Metaphasen nur bei einer Konzentration von 2000microM signifikant im Vergleich zu den Zellen aus den Kontrollkulturen erhöhte. Die anderen getesteten NDELA-Konzentrationen auch die in den 73 Stunden-Kulturen eingesetzten erhöhten die Aberrrationsrate in den Metaphasechromosomen, allerdings statistisch nicht signifikant. Nach MMC-Behandlung (6microM) zeigten 27,5%, nach DES-Behandlung (100microM) 7,6% und nach Bleomycin-Behandlung (10microg/ml) 8,8% der Metaphasen Aberrationen. Damit war die Anzahl geschädigter Metaphasen im Vergleich zu den Zellen unbehandelter Kontrollkulturen nach MMC-Inkubation (6microM) und nach Bleomycin-Applikation (10microg/ml) statistisch hoch signikant, nach DES-Inkubation (100microM) allerdings nicht signifikant erhöht. Die PCC-Technik erwies sich als die im Vergleich zur Metaphasenanalyse sensitivere Methode. Alle getesteten Substanzen erhöhten die Anzahl der Chromatinelemente/Zelle dosisabhängig. Unbehandelte Lymphozyten wiesen zwischen 1,0 und 1,8 Fragmente pro geschädigte Zelle auf. Dabei waren zwischen 6,1 und 15,8% der unbehandelten Zellen geschädigt. Nach CA-Inkubation (240microM) stieg die Zahl geschädigter PCCs auf 48,7% an, wobei 3,4 Fragmente pro geschädigte Zelle zu beobachten waren. Nach Behandlung der Zellen mit HX(150microM) waren 42,9% der Zellen geschädigt und wiesen 4,6 Fragmente pro geschädigte Zelle auf. Damit war die Zunahme der Schädigung im Vergleich zur Kontrolle hoch signifikant. Die Inkubation mit NDELA schädigte die Lymphozyten in der G0-Phase bereits ab einer Konzentration von 1000microM hoch signifikant. Dabei waren 56,6% der Lymphozyten geschädigt und es traten 4,1 Fragmente pro geschädigte Zelle auf. Nach Inkubation mit MMC (20microM) waren 46,3% der Zellen geschädigt und wiesen 3,3 Fragmente pro geschädigte Zelle auf. Die Behandlung der Lymphozyten mit DES (200microM) induzierte in 26,3% der Zellen mehr als 46 Chromatinelemente pro Zelle, wobei 2,8 Fragmente pro geschädigte Zelle auftraten. Nach Behandlung der Lymphozyten mit a,b-ungesättigten Aldehyden wurde in den PCCs zusätzlich ein interessantes Phänomen beobachtet: die vorzeitig kondensierten Chromosomen erschienen im Vergleich zu den PCCs unbehandelter Zellen weniger stark kondensiert. Um das Ausmaß der Entspiralisierung erfassen zu können, wurden die PCCs zunächst semiquantitativ gemäß ihrem Kondensationsgrad in 4 Kategorien eingeteilt, wobei der Kategorie 1 die am stärksten kondensierten PCCs, der Kategorie 4 die am wenigsten kondensierten PCCs zugeordnet wurden. Bei einer CA-Konzentration von 480microM waren 55,6% und einer HX-Konzentration von 300microM waren 57,4% der untersuchten Zellen Kategorie 4 zuzuordnen. Durch die Kombination der PCC-Technik mit der Fluoreszenz in situ-Hybridisierung und den Einsatz einer Painting Sonde (exemplarisch für Chromosom 4) wurde die Längenveränderung der PCCs genauer quantifiziert werden. Dazu wurde die Länge der Chromosom 4-PCC vor und nach Behandlung mit Crotonaldehyd (240microM und 480microM) mit einem computergestützten Programm ausgemessen. So ergab sich nach Crotonaldehyd-Behandlung (480microM) durchschnittlich eine Längenzunahme um das zwei- bis dreifache. Elongierte PCCs wurden nach Inkubation der Lymphozyten mit NDELA und Bleomycin nicht beobachtet; nach Inkubation mit den Mutagenen MMC (20microM) und DES (200microM) trat dieses Phänomen nur leicht auf. Reparaturkinetikstudien mit den Hemmstoffen Arabinofuranosylcytosin, Hydroxyharnstoff und Novobiocin lassen eine verstärkte Excisionsreparatur als Ursache für die beobachtete verminderte Kondensation der PCCs nach Inkubation mit a,b-ungesättigten Aldehyden unwahrscheinlich erscheinen. Die nach Inkubation mit a,b-ungesättigten Aldehyden beobachtete verminderte Kondensation der PCCs ist eher das Resultat von Veränderungen der mitotischen Faktoren und/oder Chromatinstrukturen. Möglicherweise interferieren a,b-ungesättigte Aldehyde mit den Phosphorylierungsprozessen der Histone H1 und/oder H3, die für die PCC-Induktion bedeutsam sind und die durch die Aktivität der mitotischen Faktoren vermittelt werden.
Apoptoseinduzierende und antimutagene Wirkung von Viscum album L. auf humane Zellkulturen
Petra Hahn
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die apoptoseinduzierende und wachstumshem-mende Potenz der Mistelextrakte Helixor Abietis (Tannenmistel), Mali (Apfelbaummistel) und Pini (Kiefernmistel) sowie der isolierten Mistellektine I und III auf die humane Leukämiezellli-nie MOLT-4 und isolierte Lymphozyten gesunder Probanden mittels 1- und 2-Parameter-Durchflusszytometrie und Fluoreszenzmikroskopie bestimmt. Eine mögliche antimutagene und DNA-stabilisierende Wirkung der Frischpflanzenextrakte Helixor A, M und P auf kulti-vierte Lymphozyten gesunder Versuchspersonen wurde anhand des SCE- und Mikronuk-leus- Tests untersucht. Sowohl bei der durchflusszytometrischen und fluoreszenzmikroskopi-schen Auswertung als auch bei den Mutagenitätstests sollten außerdem eventuelle ge-schlechtsspezifische und wirtsbaumspezifische Wirkungen der drei unfermentierten Mis-telpräparate analysiert werden. Nach 72 h Inkubation der lymphatischen Leukämiezellen mit den Mistelextrakten Helixor A, M und P (2,5 150 microg/ml) bei unterschiedlichen FKS-Konzentrationen (15 2,5 %) konnte eine dosisabhängige Zunahme der apoptotischen Zellpopulation bei abnehmendem FKS-Gehalt festgestellt werden. Dabei zeigte das Präparat aus der Kiefernmistel die stärkste apopto-seinduzierende und wachstumshemmende Potenz, gefolgt von dem Präparat aus der Apfel-baummistel und dem Extrakt aus der Tannenmistel. Eine 72 h Kultivierung mononukleärer Zellen des peripheren Blutes gesunder weiblicher und männlicher Probanden mit den drei Helixor-Präparaten (50 200 microg/ml) resultierte ebenfalls in der Induktion des programmierten Zelltodes, wobei auch hier Helixor Pini das stärkste a-poptoseinduzierende Potential aufwies. Durchflusszytometrisch und fluoreszenzmikrosko-pisch konnten keine signifikanten geschlechtsspezifischen Unterschiede nachgewiesen wer-den. Die Bestimmung der Wachstumsrate mithilfe des Trypanblau-Ausschlusstests ergab je-doch eine signifikant niedrigere Wachstumsrate für Lymphozyten weiblicher Probanden bei Helixor Mali Konzentrationen von 100 und 200 microg/ml. Für die Leukämiezelllinie MOLT-4 konnte nach 72 h Inkubation mit den Mistellektinen I und III im Konzentrationsbereich von 0,05 20 ng/ml die Induktion des programmierten Zelltodes sowohl durchflusszytometrisch als auch fluoreszenzmikroskopisch nachgewiesen werden, wobei Mistellektin III die stärkere Wirkung zeigte. Nach 72 h Kultivierung isolierter Lymphozyten gesunder weiblicher und männlicher Proban-den mit den beiden isolierten Lektinen konnte ebenfalls ein signifikanter Anstieg der apopto-tischen Zellpopulation verzeichnet werden. Auch hier wies Mistellektin III die stärkere apop-toseinduzierende Potenz auf, signifikante geschlechtsspezifische Unterschiede traten nicht auf. Die Auswertung des SCE-Tests ergab nach 71 h Inkubation mit den Mistelpräparaten Helixor A, M und P (2,5 20 microg/ml) eine signifikante Abnahme der SCE-Rate bei Vollblutkulturen ge-sunder weiblicher und männlicher Probanden. Es traten jedoch keine wirtsbaumspezifischen oder geschlechtsspezifischen Unterschiede auf und auch die Zellzyklusverteilung und das Proliferationsverhalten veränderten sich unter Einwirkung der drei Extrakte nicht. Nach einer 71 h Kombinationsbehandlung der Helixor-Präparate mit den Zytostatika Cyc-lophosphamid (40 microg/ml), 5-Fluorouracil (5 microg/ml) bzw. Methotrexat (3 microg/ml) konnte eben-falls eine Abnahme der SCE-Rate, die durch die drei Zytostatika signifikant erhöht wurde, nachgewiesen werden. Die durch CP, 5 FU und MTH induzierten Veränderungen der Zell-zykluskinetik und des Proliferationsindexes konnten durch Helixor A, M und P jedoch nicht signifikant beeinflusst werden. Die Bestimmung der SCE-Rate ergab keine wirtsbaumspezifi-schen oder geschlechtsspezifischen Unterschiede. Nach Durchführung des Mikronukleus-Tests an Vollblutkulturen gesunder männlicher und weiblicher Blutspender konnte unter Einwirkung der Helixor-Extrakte Abietis, Mali und Pini (2,5 20 microg/ml) eine schwach signifikante Abnahme der MN-Rate festgestellt werden, wäh-rend der Mitose-Index unbeeinflusst blieb. Auch hier traten keine geschlechtsspezifischen o-der wirtsbaumspezifischen Unterschiede auf. Eine 71 h Kombinationsbehandlung der Lymphozyten mit den Frischpflanzenextrakten (2,5 20 microg/ml) und den Zytostatika CP (40 microg/ml), 5 FU (5 microg/ml) bzw. MTH (3 microg/ml) ergab eine signifikante bzw. hoch signifikante Abnahme der MN-Rate. Geschlechtsspezifische oder wirtsbaumspezifische Unterschiede wurden nicht gefunden. Der Mitose-Index wurde durch die Behandlung nicht wesentlich verändert.
Stammesgeschichte der Lichinaceae: Studien in Richtung einer natürlichen Konzeption und Gliederung der Familie und ihrer Gattungen
Matthias Schultz
Die Flechtenfamilie Lichinaceae (lichenisierte Ascomyceten) wurde erstmals einer umfassenden phylogenetischen Studie unterzogen. Anlaß waren die gravierenden Widersprüche in der Konzeption und Umschreibung der Familie und ihrer Gattungen sowie die Tatsache, daß die stammesgeschichtlichen Beziehungen der Familie und ihrer Gattungen völlig unzureichend bekannt waren. Als Ursachen wurden die zahlreichen Konflikte in der Merkmalsverteilung erkannt. Diese wurden in zurückliegenden Arbeiten über die Lichinaceae oft subjektiv gelöst oder auch gänzlich ignoriert. Daher bestand das Ziel der Arbeit darin, den Merkmalsumfang der Lichinaceae zunächst kritisch zu überprüfen und auf der Grundlage phylogenetisch-systematischer Methodik neu zu analysieren. Neben klassischen Merkmalen wurden als weitere Informationsquelle Sequenzdaten des Gens der kleinen ribosomalen Untereinheit (18S rDNA) benutzt. Die Merkmalsanalysen wurden manuell und rechnergestützt durchgeführt. Die Berechnung der Stammbäume wurde zunächst nach Datentyp getrennt und danach kombiniert vorgenommen. Der Typ, die Art der Zustandsänderung und das Gewicht morphologischer Merkmale wurden in verschiedenen Berechnungen variiert. Die Sequenzdaten wurden nach vorgegebenen Standards als ungeordnet und gleich gewichtet definiert. Nach den gewonnen Erkenntnissen ist die Ordnung Lichinales eine monophyletische Einheit, die aus den Familien Peltulaceae, Lichinaceae, Gloeoheppiaceae und Heppiaceae aufgebaut ist. Die Ordnung gründet sich mutmaßlich auf den Besitzt unitunicat-rostrater Asci sowie Befunde aus 18S rDNA-Analysen. Die Beziehungen der Lichinales sind noch weitgehend ungeklärt, doch ist eine nähere Verwandtschaft mit den Lecanorales oder einer Teilgruppe daraus anzunehmen. Die Familie Lichinaceae im herkömmlichen Sinne konnte nicht als Monophylum begründet werden. Durch den Einschluß der Heppiaceae und Gloeoheppiaceae konnte der prototunicate Ascus als mutmaßliche Autapomorphie der Lichinaceae in erweiterter Fassung gefunden werden und die Familie damit den Peltulaceae als Schwestergruppe gegenüber gestellt werden. Die Entstehung des prototunicaten Ascus der Lichinaceae wurde als Reduktionsfolge interpretiert. Es muß angenommen werden, daß unitunicat-rostrate Asci in den Lichinales mehrfach entstanden sind. Die gleich sparsame Alternative, daß der prototunicate Ascus mehrfach reduziert wurde, mußte zumindest vorläufig abgelehnt werden, da dies ein mehrfaches Entstehen des Ontogenie-Typs Pycnoascocarp gefordert hätte. Letzteres ist nach den gewonnenen Erkenntnissen sehr unwahrscheinlich. Anatomische Details, die Wuchsform oder Pyknidien taugen nicht zur Abgrenzung monophyletischer Gruppen oberhalb der Gattungsebene. Das hohe Maß an Parallelentwicklungen in dieser Ebene behinderte die phylogenetische Analysen zum Teil erheblich. Die Ergebnisse wurden in ein geschriebenes System und eine darauf aufbauende Klassifikation integriert. Es wurde eine Emendierung der Lichinaceae vorgenommen und darin die Heppiaceae und Gloeoheppiaceae in die Synonymie verwiesen. Die Gattung Thyrea wurde emendiert. Jenmania ist nach den gewonnenen Erkenntnissen in der ursprünglichen Form als monotypische Gattung zu belassen. Die Gattung Paulia wurde erweitert. Die Namen folgender Taxa wurden provisorisch umkombiniert: Jenmania osorioi Henss. = Thyrea osorioi (Henss.) Schultz, Synalissa nitidula Müll. Arg. = Paulia nitidula (Müll. Arg.) Schultz, Synalissa salevensis Müll. Arg. = Paulia salevensis (Müll. Arg.) Schultz. Folgende Artnamen wurden in die Synonymie verwiesen: Thyrea schroederi Zahlbr. = Paulia nitidula (Müll. Arg.) Schultz, Paulia schroederi (Zahlbr.) Henss. = Paulia nitidula (Müll. Arg.) Schultz. Es wurde ein Schlüssel zur Bestimmung aller derzeit in die Lichinaceae gestellten Gattungen vorgelegt sowie einige Schlüssel zur Bestimmung der Arten überarbeitet, erweitert oder neu erstellt.
Evolution nicht-mitochondrialer Nukleotid-Transporter
Nicole Linka
Die Evolution plastidärer und eubakterieller Nukleotid-Transporter, die man aufgrund biochemischer und molekularer Eigenschaften zur Familie der nicht-mitochondrialen Nukleotid-Transporter zusammenfasst, ist noch völlig ungeklärt. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde die evolutive Sequenzverwandtschaft dieser nicht-mitochondrialen Nukleotid-Transportern aus Pflanzen und Eubakterien eingehender untersucht. So konnten folgende wichtige Fragestellungen beantwortet werden: 1. Ist der nicht-mitochondriale Nukleotid-Transporter ausschließlich auf intrazelluläre Bakterien und Plastiden beschränkt? Unter Anwendung molekularbiologischer Techniken sowie der Computer-gestützten Analyse laufender Genom- und EST-Projekte wurde im gesamten Organismenreich (Eu- und Prokaryoten) nach weiteren homologen nicht-mitochondrialen Nukleotid-Transportern gesucht. Aufgrund der gewonnenen Daten konnte postuliert werden, dass die nicht-mitochondrialen Nukleotid-Transporter innerhalb der Eukaryoten ausschließlich auf Plastiden-haltige Organismen beschränkt und damit im gesamten Pflanzenreich verbreitet sind. Innerhalb der Prokaryoten wurden Mitglieder dieser Transporter-Familie bislang nur in einigen wenigen endosymbiontisch bzw. endoparasitisch lebenden Eubakterien identifiziert, die der Gattung Rickettsiales und Chlamydiales angehören. 2. Wie haben sich diese Transporter innerhalb der beiden Organismenreiche entwickelt? Aufgrund der molekularen Identifizierung eines nicht-mitochondrialen Nukleotid-Transporters aus Cyanophora paradoxa, konnte ein monophyletischer Ursprung aller homologen plastidären Transportproteine postuliert werden, da somit die älteste bzw. ursprünglichste Pflanze ein entsprechendes Transportsystem besitzt. Darüber hinaus wurde angenommen, dass im Verlauf der Pflanzenevolution zwischen niederen und höheren Pflanzen infolge der Ausbildung höherer Organisationsformen (Vielzeller) und der Differenzierung in Gewebe bzw. Organen Genduplikationen stattgefunden haben. Das eingeschränkte Vorkommen der nicht-mitochondrialen Nukleotid- Transporter innerhalb der Eubakterien wurde dadurch erklärt, dass die Chlamydien und Rickettsien als obligat intrazellulär lebende Eubakterien von der Außenwelt abgeschirmt sind und daher keine Möglichkeit zum Genaustausch mit weiteren Bakterienspezies besitzen. Dass Vorkommen eines solchen Transportsystems in Vertreter wurde in dieser Arbeit als mögliche Folge eines horizontaler Gentransfers diskutiert. 3. Woher stammt das Gen (Ursprung des Gens) und über welche möglichen evolutiven Wege könnte es auf die jeweiligen Organismen übertragen worden sein? Zahlreiche Indizien sprechen für eine de novo -Entstehung der pflanzlichen Nukleotid-Transporter im Zuge der primären Endosymbiose zwischen einem heterotrophen Eukaryoten und einem Cyanobakterium (Entstehung der ersten Pflanzenzelle). Bei dieser Neuentstehung wurde ein möglicher evolutiver Zusammenhang zwischen den mitochondrialen und nicht-mitochondrialen Nukleotid- Transportern indiziert, der für eine homologe Entwicklung der Sequenzmotive GLGANVALIF/V, MAYIPLD und GKSGGA in beiden Transporter-Familie sprechen könnte. Für den chlamydialen Nukleotid-Transporter wurde in der vorliegender Arbeit postuliert, dass Chlamydien dieses Gen sowie einige andere pflanzliche Gene mittels horizontalen Gentransfer aus einer frühen, einzelligen Pflanzenzelle erworben haben. Ferner wurde diskutiert, welche Wege für einen horizontaler Gentransfer zwischen Rickettsien und Chlamydien bzw. Rickettsien und Pflanzen möglich sein könnten, um das Vorkommen rickettsieller Nukleotid-Transporter zu erklären. 4. Inwiefern haben sich die Transporteigenschaften nicht-mitochondrialer Nukleotid- Transporter im Laufe ihrer divergenten Entwicklung verändert? Der nicht-mitochondriale Nukleotid-Transporters aus Holospora obtusa (NPTHo), einem obligaten Endosymbiont des Pantoffeltierchens, zeichnet sich im Vergleich zu den bisher charakterisierten Nukleotid-Transporter durch einzigartige Transporteigenschaften aus, die dem intrazellulären Eubakterium einen erheblichen Selektionsvorteil verleihen. Aus den kinetischen Daten des NPTHo- Protein wurde ein neuer Phosphat-gekoppelten Transportmechanismus postuliert, der auf die nichtmitochondrialen Nukleotid-Transporter übertragen ist, wodurch sich die generellen Probleme des bislang postulierten einfachen ATP/ADP-Antiports lösen lassen.
Inhibitoren der humanen induzierbaren NO-Synthase aus Pilzen - Einfluss der kleinen G-Proteine der Rho-Familie auf die Expression der humanen induzierbaren NO-Synthase
Michael Hausding
Das erste Ziel dieser Arbeit war es, Verbindungen aus imperfekten Pilzen zu selektieren und zu isolieren, die ueber die Hemmung des JAK2-STAT-1alpha-Signalweges die Induktion der iNOS-Expression in humanen A549/8-Zellen, humanen Lungen-Alveolarepithel-Karzinom-Zellen, negativ beeinflussen. Es konnten drei Verbindungen aus unterschiedlichen Penicillium-Staemmen isoliert werden, die durch Reportergen-Analysen betreffend der Wirkung der Rohfermentationsprodukte auf die iNOS-, eNOS-Promotor-Aktivitaet sowie der STAT-1alpha-abhaengigen Promotor-Aktivitaet selektiert wurden. Die Substanzen Sporogen-A01, S-Curvularin sowie S14-95 zeigten in den Reportergen-Analysen aehnliche Aktivitaeten, die sich nur in der Potenz unterschieden. Waehrend Sporogen-A01 und S-Curvularin eine, wenn auch konzentrationsunabhaengige, Hemmung auf die NF-kappaB-abhaengige Promotor-Aktivitaet in HeLa-S3-Zellen zeigten, so ergab sich fuer S14-95 kein Einfluss auf diesen Signaltransduktionsweg. Bei S14-95 scheint es sich um eine spezifisch die IFN-gamma-abhaengigen Wege der transkriptionellen Aktivierung der iNOS hemmende Verbindung zu handeln. Die Effekte dieser Substanz auf den humanen TNF-alpha-Promotor liegen wie auch fuer S-Curvularin bei 80% Hemmung und auch der humane COX-2-Promotor wurde durch alle drei Substanzen in Reportergen-Analysen stark gehemmt. In A549/8-Zellen zeigten die Substanzen keine (S14-95 und S-Curvularin) oder lediglich geringe (Sporogen-A01) Wirkung auf die Zellproliferation. Die Verbindungen stellen wichtige Strukturen dar, die bei der pharmakologischen Unterdrueckung der NO-Produktion in pathophysiologischen Situationen eine Rolle spielen koennten. Im zweiten Teil wurde in humanen DLD1-Zellen, Kolon-Adenokarzinom-Zellen, und A549/8-Zellen die Regulation der iNOS-Expression durch kleine G-Proteine der Rho-Familie, die bekanntermassen in den Signaltransduktionsweg von Cytokinen involviert sind, untersucht. Atorvastatin und Lovastatin (HMG-CoA-Reduktase-Hemmer), die Ras- und Rho-Proteine gleichermassen indirekt hemmen, indem sie ihre essentielle Membranverankerung verhindern, erhoehten die Cytokin-induzierte NO-Produktion und iNOS-mRNA-Expression in den untersuchten humanen Zellen auf das 2 bis 4-fache, ohne jedoch selbst die Expression der iNOS induzieren zu koennen. DLD1- und AKN1-Zellen, die stabil mit einem 16kb-Fragment des humanen iNOS-Promotors vor einem Luziferase-Reportergen transfiziert worden waren, zeigten in Gegenwart von Atorvastatin oder Lovastatin eine mehr als 2,5-fache Steigerung der Cytokin-induzierten Luziferaseaktivitaet, was fuer eine erhoehte Transkriptionsrate als Ursache der erhoehten iNOS-mRNA-Spiegel spricht. In A549/8piNOS(16)Luc-Zellen erhoehten die beiden Statine die Luziferaseaktivitaet dagegen in einem weitaus geringerem Masse, so dass in diesen Zellen eine Beteiligung posttranskriptioneller Mechanismen, im Sinne einer erhoehten iNOS-mRNA-Stabilitaet, anzunehmen ist. Die beobachtete Statin-vermittelte Verstaerkung der Cytokin-induzierten iNOS-mRNA-Expression und iNOS-Promotoraktivitaet konnte durch Substitution von Mevalonat und Geranylgeranylpyrophosphat wieder vollstaendig aufgehoben werden, waehrend die Koinkubation mit FPP nur eine geringfuegige Reduktion zur Folge hatte. Die Superinduktion war somit das Ergebnis einer spezifischen Hemmung der HMG-CoA-Reduktase und beruhte auf der Hemmung posttranslational geranylgeranylierter Proteine. Vor dem Hintergrund, dass die kleinen G-Proteine der Rho-Familie vorwiegend geranylgeranyliert und die der Ras-Familie hauptsaechlich farnesyliert werden, scheint die Cytokin-induzierte iNOS-Expression durch Rho-Proteine negativ reguliert zu werden. Diese Hypothese konnte dadurch verifiziert werden, dass auch Clostridium difficile Toxin B - das durch UDP-Glucosylierung saemtliche Rho-Proteine (Rho, Rac, Cdc42) direkt inaktiviert, Ras-Proteine jedoch unbeeinflusst laesst - die Cytokin-induzierte iNOS-mRNA-Expression in den humanen Zellen auf mehr als das Dreifache zu steigern vermochte.
Optisches On-line-Verfahren zur Trockengewichtsbestimmung bei Fermentationen von filamentösen Pilzen
Eveline geb. Tonfack Ganpo-Nkwenkwa
In der vorgelegten Arbeit wurde eine neue Technik untersucht, mit deren Hilfe das Myzeltrockengewicht bei Fermentationen von filamentösen Pilzen im On-line-Verfahren über optische Messungen bestimmt werden kann. Das Verfahren beruht auf der Messung der Lichtstreuung resp. der diffusen Reflexion des Myzels in einem Fermenter. Eine theoretische Beschreibung der diffusen Reflexion resp. der Lichtstreuung großer und völlig unregelmäßiger Partikel, wie man sie bei den filamentösen Pilzen findet, kann im Augenblick nicht gegeben werden. Aus diesem Grund muss für die Anwendung das Verfahren über empirische Befunde abgesichert werden. Um externe Eichkurven erstellen zu können, wurde ein Probengefäß von der Form eines "Hornes" resp. der Form einer klassischen Lichtfalle und ein Rührsystem für die Off-line-Messungen entwickelt, in dem die Fehler der Eichmessungen durch die Reflexionen von den Glaswänden des Probengefäßes und des Rührsystems stark reduziert werden. Die Verfälschung der Intensität der Reflexion und der Lichtstreuung konnte dabei um den Faktor 62 vermindert werden. d.h. der Fehler bei kleinen Teilchenkonzentrationen wurde dadurch reproduzierbar um mehr als 100 % verringert. Die Einsatztauglichkeit des entwickelten Probengefäßes und des Rührsystems wurde mit Streulichtmessungen an Polystyrolteilchen der Firmen Duke Scientific Corporation und BASF mit einer den Pellets ähnlichen Größe überprüft. Für die Interpretation der gemessenen Intensitätstkurven ergab sich der wichtige Befund, dass bei diesen Polystyrolteilchen keine wesentliche Wellenlängenabhängigkeit der Streulichtintensität gefunden wurde. Es wurden sieben verschiedenen filamentöse Pilze mit der entwickelten Streulicht/diffusen Reflexionsmethode untersucht, um deren Verwendbarkeit zur Trockengewichtsbestimmungsmethode abzusichern. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass eine On-line-Trockengewichtsbestimmung bei Fermentationen von filamentösen Pilzen über Streulichtintensitäten/diffuse Reflexionsintensitäten möglich ist. Diese Methode ist nur anwendbar, wenn die Intensitätsveränderungen des Anregungslichtes sich während der Fermentation nicht wesentlich ändert, d.h. innerhalb der Fehler der Methode liegt. In einer Arbeit von Koch wurde bei Bakterien gezeigt, dass die Streulichtintensität proportional zum Volumen der Bakterien und nicht zur Bakterienanzahl ist. Die Analyse der Pelletgrößenverteilungen bei filamentösen Pilzen hat auch gezeigt, dass die Streulichtintensität proportional zum Myzeltrockengewicht unabhängig von der vorliegenden Größenverteilung ist. Trotz dieser Befunde bleiben die Ursachen der Intensitätsveränderungen bei der Fermentationen von verschiedenen Pilzen, d.h. die unterschiedlichen Steigungen im linearen Zusammenhang zwischen Myzeltrockengewicht und Intensität, ungeklärt.