Southern- und Northern-Blot
Ziel des Nucleinsäure-Blottings ist der spezifische Nachweis von Nucleotidsequenzen in DNA- oder RNA-Fragmenten, die auf einer Matrix fixiert sind.
Dazu werden Nucleinsäuren (DNA beim Southern-Blot bzw. RNA beim Northern-Blot) zunächst im Agarosegel elektrophoretisch nach ihrer Größe aufgetrennt und anschließend entsprechend ihrer Position im Gel auf eine Membran übertragen (Blotting). Die Membran wird mit einer spezifischen, markierten RNA- oder einzelsträngigen DNA-Sonde inkubiert. Die Sondenmoleküle binden über Wasserstoffbrücken an ihre komplementären Sequenzen in den fixierten Nucleinsäuren. Die Detektion der gebundenen Sondenmoleküle erfolgt abhängig von der Markierung der Sonde (radioaktiv oder mit einem Hapten).
Zahlreiche in der Gentechnik angewendete Methoden beruhen auf der Hybridisierung (antiparallele Reassoziation) von zwei komplementären einzelsträngigen Nucleinsäuren über die Ausbildung von Wasserstoffbrücken zu einem Doppelstrang z.B. Microarray. Mithilfe der Hybridisierung lassen sich die Struktur, Organisation und Expression von Genen analysieren.
Neben Methoden zur Hybridisierung von Nucleinsäuren in Lösung gibt es Verfahren, bei denen einer der beiden komplementären Stränge auf einer festen Matrix immobilisiert ist. Die fixierten DNA- oder RNA-Moleküle werden mit einer markierten einzelsträngigen Nucleinsäuresonde hybridisiert. Auf diese Weise lassen sich komplementäre Zielsequenzen in einem komplexen Gemisch von Nucleinsäuremolekülen detektieren.
Als werden vorwiegend Nylonmembranen verwendet. Die können radioaktiv markiert sein. Mittlerweile werden jedoch häufig auch nicht radioaktiv markierte Sonden eingesetzt, an die beispielsweise ein Hapten kovalent gebunden ist, das von spezifischen enzymgekoppelten Antikörpern gebunden wird. Der Nachweis der gebundenen Sondenmoleküle erfolgt hier mittels Detektion der Enzymreaktion nach Zugabe eines Substrats.
Fachlicher Beirat: Prof. Dr. Dr. Melanie Königshoff, 21.11.2018
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