MoNLightBoNT-Assay - eine In vitro-Methode zur Aktivitätstestung von Botulinum-Neurotoxinen
in vitro, MoNLightBoNT, Motoneuronen, Luciferase
Der MoNLightBoNT-Assay befindet sich noch in der Entwicklung, soll aber langfristig validiert werden, um als Ersatzmethode für den Maus-Letalitätstest zur Aktivitätstestung verschiedener Botulinum Neurotoxin (BoNT)-enthaltenden Produkten, wie beispielsweise Botox®, eingesetzt zu werden.
Da BoNTs durch Bakterien (Clostridium botulinum) hergestellt werden, muss jede Charge des Medikaments auf Aktivität getestet werden. Zumeist findet dies über den Maus-Letalitätstest statt. BoNTs spalten bestimmte Proteine in Nervenzellen, die daran beteiligt sind, Signalstoffe (Neurotransmitter), wie Acetylcholin, freizusetzen. Über die Hemmung dieser Freisetzung wird die Reizweiterleitung von motorischen Nervenzellen (Motoneuronen) auf den Muskel unterdrückt. Es kommt in Folge zu einer schlaffen Lähmung.
Im Maus-Letalitätstest wird die Wirkung der BoNT-Zubereitungen darüber quantifiziert, wie viel Substanz eingesetzt werden muss, um bei der Hälfte der Versuchstiere eine Zwerchfelllähmung herbeizuführen. Da dieser Tierversuch starke Schmerzen und Stress für die Versuchstiere bedeutet, müssen, nach dem 3R Prinzip, Ersatzmethoden entwickelt werden. Bereits validierte Alternativmethoden nutzen größtenteils Nervenzelllinien, um die Spaltung dieser Proteine zu quantifizieren. Da jedes Produkt allerdings eines von vielen Proteinen an einer ganz bestimmten Stelle spaltet, funktioniert ein solcher Test nur für ein spezielles Produkt.
Für den MoNLightBoNT-Assay werden menschliche Motoneuronen aus Stammzellen differenziert. Diese Stammzellen sind gentechnisch bearbeitet. In den daraus entstehenden Motoneuronen, wird eine Luciferase, also ein Enzym, in die neuronalen Vesikel sortiert. Diese Luciferase soll, wenn die Nervenzellen angeregt werden, parallel mit dem Neurotransmitter Acetylcholin freigesetzt werden. Dabei entsteht durch den Umsatz eines Substrates Licht. Seine Freisetzung wird, wie die von Acetylcholin, durch die Zugabe von BoNTs unterdrückt. Demnach wird abhängig von der Aktivität des zugegebenen BoNTs weniger Licht freigesetzt. Dieses System wurde zunächst in einer Krebszelllinie etabliert (Pathe-Neuschäfer-Rube et al., 2015) und wird hier auf die eigentlichen Zielzellen von BoNTs, die Motoneuronen, übertragen, da diese besonders empfindlich gegenüber verschiedenen BoNTs sind (Schenke et al., 2020). Somit wird der MoNLightBoNT-Assay geeignet sein, um in Zukunft die Aktivität unterschiedlicher BoNT-enthaltenden Produkte zu testen.
Die MoNLightBoNT-Entwicklung wurde durch das BMBF gefördert (031 L01 32A/B).