In vivo Markierung von Zellen zur Untersuchung von Diffusionsprozessen mithilfe der Bildgebenden Diffusionsmikroskopie (DIFIM)
Heinlein, Pia Irena
English Title: In vivo labelling of cells for the investigation of diffusion processes by means of Diffusion Imaging Microscopy (DIFIM) Diese Arbeit widmet sich der Anwendung der in den letzten Jahren entwickelten Bildgebenden Diffusionsmikroskopie (DIFIM) auf lebende Zellen. Die Methode erlaubt die Detektion von Intensitätsfluktuationen über einen großen, mehrere Mikrometer umfassenden Bereich. Sie ermöglicht zugleich die Diskriminierung des Fluoreszenzsignals von störender Hintergrundfluoreszenz anhand von Fluoreszenzlebensdauermessungen. DIFIM wurde an einem Testsystem in lebenden Zellen, bestehend aus einem farbstoffmarkierten Oligonukleotid, welches an den PolyA-Strang der zelleigenen mRNA hybridisieren kann, untersucht. Es wurde gezeigt, dass es mithilfe von DIFIM möglich ist, unterschiedliche Diffusionszeiten in lebenden Zellen zu visualisieren. Damit wurde der Grundstein gelegt, um Wechselwirkungen verschiedener Proteine innerhalb einer Zelle zu verfolgen. Zur Demonstration der Anwendbarkeit von DIFIM in der Biologie wurde der JAK-STAT-Signalweg genauer untersucht. Im Speziellen sollte die Diffusion des Proteins STAT5b verfolgt werden. Hierfür wurde zunächst die in vivo Markierung des Proteins mit einzelmolekültauglichen, rot fluoreszierenden Farbstoffen untersucht. Zur Markierung wurde ein Fusionsprotein mit dem sogenannten SNAP-Tag eingesetzt, der eine spezifische kovalente Bindung synthetischer Farbstoffe an gewünschte Proteine ermöglicht. Es stellte sich heraus, dass die Markierung mittels Inkubation unspezifisch war, weshalb die Markierung unter Verwendung von Transfektionsreagenzien durchgeführt wurde. Auch diese ermöglichten in lebenden Zellen keine charakteristische Markierung. Weiterführend wurden Zellen mit einem Fusionsprotein aus STAT5b und mCherry, ein Derivat des Rot-Fluoreszierenden Proteins, transfiziert. Derartig behandelte Zellen ermöglichten es erstmals, Unterschiede in Diffusionszeiten in in vivo DIFIM-Messungen zu beobachten. This work has been dedicated to the application of the recently developed Diffusion Imaging Microscopy (DIFIM) to living cells. The method allows the detection of intensity fluctuations over a large, several micrometer comprising region. Furthermore the discrimination of the fluorescence signal from disturbing background fluorescence is enabled by means of fluorescence lifetime measurements. DIFIM was studied using a test system, composed of a dye labelled oligonucleotide, which can hybridise to the polyA-tail of natural cell mRNA. It has been shown that DIFIM enables the visualisation of varying diffusion times in vivo. Therewith the basis for investigations of interactions between various proteins within a cell was established. For demonstration of the applicability of DIFIM in biology the JAK-STAT signalling pathway was examined in more detail. Especially diffusion of the protein STAT5b should be tracked. Therefore, in vivo labelling of the protein using synthetic red fluorescing markers suitable for single-molecule experiments were employed at first. A fusion protein with the so-called SNAP-Tag was adopted as marker. The SNAP-Tag allows a specific covalent bonding of synthetic dyes to a favoured protein. It turned out that labelling via incubation was unspecific. For this reason marking using different transfection reagents was examined, but these, enables no specific labelling, as well. Continuatively cells were transfected with a fusion protein containing STAT5b and mCherry, a derivative of the red fluorescent protein. Using those cells, it firstly succeeded to gain differences in diffusion times within in vivo DIFIM measurements. Einzelmolekülspektroskopie, Diffusion, CHO-Zelle, Fluoreszenz, Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie
Bildgebende Diffusionsmikroskopie, DIFIM, spezifische Markierung, Proteinmarkierung, mCherry, GFPDiffusion Imaging Microscopy, Fluorescence Correlation Spectroscopy, FCS, DIFIM, single molecule spectroscopy, fluorescent proteins, mCherry, GFP